[发明专利]一种应用甘蔗着丝粒特异重复序列开展染色体准确计数的新方法

权利要求书

1.一种应用甘蔗着丝粒特异重复序列开展染色体准确计数的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、获取甘蔗属着丝粒特异重复序列：采用着丝粒ChIP-seq分析甘蔗属内不同甘蔗种，获各个甘蔗种共有着丝粒重复序列，其序列特异存在于各个甘蔗种的着丝粒区，序列名称为CENTS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1:

AGGACCAGCAGTTGTCGGCGTGGATGTATGATCGGTGTTGATGTCCTCATCATCCTCCCTTTCTTGAATTTGAGTCGTCCTCGAGCACGAGCACGAGAACGAGTACTCTCTCTCTCTCTCTCTAGAGTAAGCCACTCGTTTAGATATGAATACTTGCTGCGTGGTTAGTTTGATATTTGTAGCACAGGGTGAACTAATTCCTCGTCCGATTGGAACTTCCAATTCTACTCAGACTTGGCCAACAGAGAGACTATATGATAGCGCGTGTTGTGATAGGAAAGTGACAAGAACTCGAAACTCTAAGGGAATAAACTAAGACCAGCAATCCGACACACCCGATGCAACCGAATATTCAACAAACCCTAACTAGGTAGCACTAGCCACGGCTCAAAGGTCTATAGGATTGCAGGAAACTAATCTACTATTTTTTTTGGCTTTTCTGGACTATAGGAAAAATAAAACAGTGAAGGATTGGAAGTCTCTCACCGATAAACCTTGCTCTGATTACCAACTGATATGAACCCGCAAGGGTTTGTGGTCGATCTTTCGATGAGAAGCGTGAGATAATTCGATTGGTGGATGGAGATGACGTTCACGGCCCGACTACAGCCTTCCAAGACTGCGCCTTAGCGACCGATACACCACTTCCCAAGGCCGTCACGATCTTGTGGAGTATGACAACCAGCCCCTAGGGCTCCCGTCCTGCAAGCAATCGAAGAACTAGCAAGAACGAGGAAACAAGCACTGAAATTGCAAGATAAAATTGAAGGTTTCACACTGAATCTTATTATGAGTGGGGTTCCGAAGACAAGGAGACGGGCGACTGGATCAGCACGCGCGCCTACAAGCAAGTAGCGATGGCTAAACTTGATCTAAACAAAACCCGAGTGTTCCTGGTGGCGGCTAAGGGGTATATAACGTGTGGAGGACGACCACAAGAGAGTTTGGGTCGTGCTCCAACCCTAGGATGCGTCCCTACTGGACTCTAAACGATACAAGCCCATTGGGCTAACTTAAGGTGGCGCAGCACCCTGGACAGAATAGACCTCTCGGTGATTTTTGGACTGTTGACGCCGCTTCTGAGCAGGTATGAGTATGATGTCAGATCCATATGAAAGTAGACTTTATTAGCTTTCCAACAAGTCCAGAATCACCCCAATCCGACTCCGTATGTAACCGTGGCGACCGTCGCAAGTTGAAGGTGTGCTGCAGTCCGAATCCAGCCTACGCGAGTCCTTTTCCCTTTCGGTCTTCTCCTTGATTCCTAATCAAAACAAGAGTGCACGTGTCTCCAAGATCTAAACAGGATGGACAAGAGCTCAAGAAGGAACTCACTTGATGATTAACTTTTCGAGCACGAGCACGAGTAATAGGACCAGCAGTTGTCGGCGTGGATGTATGATCGGTGTTGATGTCCTCATCATCCTCCCTTTCTTGAATTTGAGTCGTCCTCGAGCACGAGCACGAGCACGAGCACGAGATACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAGAGTAAGCCACTCGTTTAGATATGAATACTTGCTGCGTGGTTAGTTTGATATTTGTAGCACAGGGTGAACTAATTCCTCGTCCGATTGGAACTTCCAATTCTACTCAGACTTGGCCAACAGCGAGGAATAACCGATCCCTTGATCCGACTCAAACTTGAAAACCTACTTGGATTCGGCCAACAGAGAGGAACAACCGATTCCTTGTCCGATTCAAACTTCAAACCCT；

步骤二、分离甘蔗属着丝粒重复序列并开展计数分析，包括以下步骤：

（1）利用序列CENTS相应的分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

（2）将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化；

（3）将纯化后的PCR产物标记，该标记后的PCR产物探针在荧光原位杂交（FISH）中精确杂交着丝粒位置，通过计数该杂交信号数目来准确、简便地进行染色体计数分析；

序列CENTS相应的分子标记引物序列如SEQ ID NO. 2-3所示；

SEQ ID NO. 2： 5' ACTATTTTTTTTGGCTTTTCTGGA 3'；

SEQ ID NO. 3： 5' ACTCTTGTTTTGATTAGGAA 3'；

所述步骤二中，PCR扩增的条件为：95℃预变性3min；95℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃终延伸7min；PCR扩增反应体系为：引物各为0.25μL，DNA模板2μL，Mix 5μL，最后加入ddH₂O将总体积补足至10μL。