[发明专利]一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法

说明书

本发明公开了一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，涉及蜜蜂精子冷冻保存技术领域。将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合平衡静置1～2h后，加入冷冻保护剂平衡静置1～1.5h，然后进行程序降温，所述程序降温包括以3.5‑4℃/min的速率从3～4℃下降到‑60℃～‑50℃，程序降温过程中，当温度降到‑13℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到‑60℃～‑50℃后再降温至液氮温度。采用本发明提供的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法进行蜜蜂精子的保存，解冻后的精子活力高，用于人工授精时，蜂王产授精卵的比例高，保护液对授精蜂王危害小，蜂王使用寿命长。

技术领域

本发明涉及蜜蜂精子冷冻保存技术领域，具体而言，涉及一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法。

背景技术

蜜蜂是一种重要的经济昆虫，可以生产多种蜂产品，同时，蜜蜂也是一种生态昆虫，蜜蜂为农作物授粉产生的生态价值远远高于蜂产品的价值。

蜜蜂种质资源保护通常采用群体水平上的活体保种技术，但活体保存风险性较高，受外界因素影响较大。精子冷冻保存技术从1803年问世以来，已经在许多哺乳动物研究上取得成功，1964年Sawada和Chang首次利用7％甘油作为冷冻保护剂成功的将蜜蜂精子保存，拉开了蜜蜂精子冷冻保存的序幕。蜜蜂精子冷冻技术能够将优质蜂种的精子低温下长时间冷冻保存，最大程度地减少外界因素影响，提高蜜蜂种质资源保护的可靠性。因此，目前蜜蜂珍惜种质资源的保护除了采用群体水平上的活体保种技术以外，还采用细胞水平上的卵子和精子的低温冻存技术。蜜蜂精子冷冻技术的出现，丰富了国家级蜜蜂基因库保种技术手段，为珍惜蜜蜂种质资源保护提供技术支撑，对于蜜蜂遗传育种以及蜜蜂生物学科的发展都具有积极的意义。

蜜蜂精子冷冻保存技术发展迄今几十年，虽然取得了一定的成功，但是还存在以下问题：蜜蜂精子冷冻效果不好，冷冻结果不稳定；蜜蜂精子冷冻贮存的质量差，人工授精蜂王产受精卵的比例低；保护液对授精蜂王危害大，蜂王使用寿命短。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法以解决上述技术问题。

本发明通过优化蜜蜂精子冷冻保存技术，创新冷冻方法，对于提高蜜蜂精子冷冻保存后的精子成活力和人工授精成功率是非常有必要的。

本发明是这样实现的：

一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其包括如下步骤：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合平衡静置后，加入冷冻保护剂平衡静置，然后进行程序降温，程序降温包括以3.5～4℃/min的速率从3～4℃下降到-60℃～-50℃，程序降温过程中，当温度降到-13～-12℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到-60℃～-50℃后再降温至液氮温度。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述加入冷冻保护剂前的混合静置是指：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合，在0～4℃下静置1～2h；优选地，待保存的蜜蜂精子与稀释液混合比例为0.5-1:5。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合后，在静置前还包括混匀步骤。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述混匀步骤是先将容器置于蜜蜂精液自动混匀装置低速10～30r/min混匀10～20s，然后再调中速30～60r/min混匀10～20s。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述加入冷冻保护剂静置是指：加入冷冻保护剂后，将盛有待保存蜜蜂精子的容器置于0～4℃环境温度下，使用蜜蜂精液自动混匀装置，先低速混匀30～35s，再调中速混匀30～35s，静置1～1.5h。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述“植冰”操作是指：当温度降到-13℃时，向蜜蜂精子冻存容器中滴加液氮。