[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白的编码基因及其应用

说明书

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。本发明利用密码子优化后的S1D片段蛋白的编码基因，建立了一种大量表达猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白的制备方法，利用该制备方法可以高效表达S1D片段蛋白，纯度高，生物学活性好，利用其制备得到单克隆抗体效价高、特异性强；作为抗原建立的乳清IgA ELISA检测方法重复性、敏感性和特异性均良好。

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻技术领域，具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白的编码基因及其应用。

背景技术

流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染导致仔猪呕吐、腹泻、脱水及死亡的高度传染性疾病，不同年龄的猪均可感染，但以10日龄的仔猪死亡率最高。在我国，该病最早报道于2010年秋，之后蔓延全国。目前，该病已导致大量哺乳仔猪死亡，给养殖户造成了严重的经济损失，已成为影响我国养猪业健康发展的重要疫病之一。

PEDV具有典型的冠状病毒结构，含有4种主要结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、纤突蛋白(S)和小囊膜蛋白(E)。其中S蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，能够诱导机体产生中和抗体。因此，S蛋白在病毒感染、致病性和宿主细胞嗜性方面起关键作用。PEDV进入细胞前，在细胞蛋白酶的作用下，S蛋白裂解为S1(1～789aa)和S2 (790～1383aa)，S1折叠成球状结构域。S1蛋白的COE(胶原酶等效域)区域(499～638 aa)是诱导机体产生中和抗体的主要抗原，而S1蛋白的S1D(636～789aa)区包含1个线性抗原表位(697～742aa)和2个B细胞表位(744～759aa和756～771aa)，两者都被视为是优秀的疫苗候选抗原。

为进一步研发PEDV疫苗，需要获得大量的S1D片段蛋白作为抗原。而作为最早被人们采用、目前掌握最为成熟的技术，就是原核表达系统。它主要是将已带有克隆目的基因片段的载体转化细菌(通常是大肠杆菌)通过诱导表达获得目的蛋白。由于其遗传背景清楚，成本低、周期短，因此最常用的就是大肠杆菌的表达系统。然而，在大肠杆菌里表达外源蛋白，经常会遇到表达量低的情况，主要原因是由于外源基因的密码子是大肠杆菌非偏爱的密码子，细菌里面缺乏识别这些密码子的tRNA，而蛋白的翻译速度往往取决于tRNA，其减少会导致蛋白质合成速率降低，因此表达量不高，甚至有可能提前终止翻译。

同时，在在大量表达蛋白后，纯化方法的选择显得尤为重要，常用的方法是镍柱亲和纯化或切胶纯化，两种方法各有利弊。前一种方法可以获得较纯且具有良好活性的目的蛋白，但是在过柱过程中会损耗较多，导致纯化后的蛋白浓度不高，不利于后续小鼠的免疫；后一种方法也可以获得较纯的目的蛋白且损失不会太大，但是纯化后的蛋白不具有生物活性。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白的编码基因及其应用，本发明运用大肠杆菌常用密码子(偏爱密码子)替代稀有密码子，可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平。解决了重组蛋白在原核表达系统(大肠杆菌) 表达量低的技术问题，以达到重组蛋白在细胞内大量表达的目的，并利用其制备单克隆抗体制备及建立乳清IgA ELISA检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白的编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种重组载体。

本发明的第三个目的是提供一种工程菌。

本发明的第四个目的是提供一种大量表达猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白的制备方法。

本发明的第五个目的是提供任一所述的制备方法制备得到的猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白。

本发明的第六个目的是提供所述的猪流行性腹泻病毒S1D片段蛋白在制备猪流行性腹泻病毒检测试剂盒和/或抗猪流行性腹泻病毒抗体中的应用。