[发明专利]抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法及应用

说明书

本申请涉及抗体制备技术领域，提供了一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，该制备方法包括将石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白免疫注射羊驼，通过分离其外周血淋巴细胞的RNA克隆出羊驼抗体VHH基因，进行克隆并构建了纳米抗体免疫文库。利用噬菌体展示技术对免疫文库进行淘选，筛选出抗石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的特异性纳米抗体。该制备方法可以大量制备抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体，且得到的抗体纯度高，抗神经坏死病毒活性强，应用潜力大、前景好，有利于广泛应用。

技术领域

本申请属于抗体制备的技术领域，尤其涉及一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法及应用。

背景技术

鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN)，也称为病毒性脑病和视网膜病(viral encephalopathy and retinopathy,VER),其病原为神经坏死病毒(Nervousnecrosis virus,NNV)。NNV属于野田病毒科(nodaviridae)，β野田病毒属(Betanodavirus)，是一种小型无囊膜病毒，衣壳由180个衣壳亚单位组成，其病毒粒子为二十面体对称结构，直径大约25-30nm。NNV基因组包括2条单链正义RNA，RNA1和RNA2。RNA1编码依赖于RNA的RNA聚合酶，能复制病毒基因组，而RNA2则编码病毒唯一的衣壳蛋白的前体。根据RNA2的核苷酸差异，可以将NNV分为四种基因型：赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)、黄带鲹神经坏死病毒(striped jacknervous necrosis virus,SJNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(barfin flounder nervousnecrosis virus,BFNNV)和红鳍东方鲀神经坏死病毒(tiger puffer nervous necrosisvirus,TPNNV)。

VNN病害在世界各地被报道，严重危害了鱼类养殖的发展，被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)列为重要鱼类病害。我国农业部发文，在2018年里有监测的鱼类疫病中，病毒性神经坏死病阳性样品检出率最高。而我国NNV高发地区主要在海南、广东、福建和台湾地区，而大陆地区流行的NNV基因型是RGNNV，其主要爆发在石斑鱼幼苗中，感染的石斑鱼幼苗死亡率可以达到100％，严重危害着石斑鱼养殖。我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼，由于经常性受神经坏死病毒的感染，养殖产业损失巨大。至今尚无有效的特效抗NNV的药物或生物制剂。虽然有多种抗NNV疫苗对鱼体有一定的保护效果，但是在免疫系统还未完善发育的鱼苗中发挥的作用比较有限。

病毒粒子衣壳对宿主细胞感染有重要作用，而NNV衣壳蛋白亚单位，其主要包含3个结构域，分别参与了组装病毒粒子时募集RNA，包装衣壳形成病毒粒子，病毒与宿主细胞表面相互作用。通过制备抗NNV衣壳蛋白的抗体可以为病毒感染机制和诊断防治提供参考。

目前，已有利用NNV衣壳蛋白制备抗NNV单克隆抗体，或是制备了抗NNV的特异性卵黄抗体，但是上述制备抗体的方法工艺复杂、无法制备大量抗体；且得到的抗体纯度低、成本高、分子量大易降解失活等缺点，不利于使用。

发明内容

本申请的目的在于提供一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法及应用，旨在解决现有技术中无法大量制备高纯度的抗石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的纳米抗体的问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：

获取免疫羊驼的外周血淋巴细胞的总RNA，并进行反转录扩增得到cDNA序列；

以所述cDNA序列为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将所述羊驼抗体VHH基因与载体连接得到连接产物，将所述连接产物进行转化构建噬菌体展示文库；