[发明专利]一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用

说明书

本发明公开了一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用，包括底物、模板、APE1酶、DNA聚合酶、dNTP/dUTP混合物、UDG酶和荧光染料，底物和模板均为单链DNA，底物含有8‑氧鸟嘌呤，底物的3’端用NH₂修饰；模板由至少一条DNA1和至少一条DNA2交错连接形成，DNA1与DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1与DNA2的连接处含有腺嘌呤脱氧核苷酸；底物与DNA1、一部分DNA2互补，与8‑氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1；dNTP中不含dTTP。该检测体系能简单快速的完成检测；能够进行指数放大反应，提高了hOGG1检测的灵敏度；避免了切刻内切酶的使用，从而有效防止非特异性扩增。

技术领域

本发明属于分析检查技术领域，涉及一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶1(hOGG1)是细胞核和线粒体中一种重要的糖基化酶，作用于与胞嘧啶配对的8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，启动所有生物体中氧化鸟嘌呤碱基的切除修复过程。hOGG1水平的异常与各种疾病有关，因此准确简便的检测hOGG1的活性在疾病的预测和诊断方面具有重要意义。

据发明人研究了解，近年来，等温指数扩增反应(EXPAR)因其操作简单、反应快、放大效率高而成为一种很有前途的分子诊断技术。在经典的EXPAR实验中，切刻内切酶通常用于循环切割磷酸二酯键，使切刻位点的3’端作为引物不断地启动新一轮复制。然而在EXPAR分析中使用切刻内切酶容易引起不必要的非特异性扩增，这限制了实际应用中检测的可靠性和特异性。另外增加切刻内切酶的数量还会降低EXPAR的反应速率。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用，该检测体系能更简单快速的完成检测；能够进行指数放大反应，提高了hOGG1检测的灵敏度；避免了切刻内切酶的使用，从而有效防止在传统EXPAR系统中观察到的非特异性扩增。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种一步法荧光检测体系，包括，

底物和模板：底物和模板均为单链DNA，底物含有8-氧鸟嘌呤，底物的3’端用NH₂修饰；模板由至少一条DNA1和至少一条DNA2交错连接形成，DNA1与DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1与DNA2的连接处含有腺嘌呤脱氧核苷酸；底物与DNA1、一部分DNA2互补，与8-氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1；

APE1酶：用于切割AP位点；

DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物：用于在切除AP位点后3’OH端进行延伸反应，dNTP中不含dTTP；

UDG酶：用于清除延伸反应获得延伸产物中的尿嘧啶；

荧光染料：用于与扩增产物产生荧光。

本发明中，底物的3’端用NH₂修饰用于防止非特异性扩增。底物含有8-氧鸟嘌呤，且与8-氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1，能够使hOGG1在特定位置识别并切除8-氧鸟嘌呤产生AP位点，通过APE1酶切割产生3’OH端，然后通过DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物进行延伸反应，由于连接处的腺嘌呤脱氧核苷酸，使得尿嘧啶核苷酸掺入延伸产物中，再通过UDG酶识别并切除尿嘧啶，然后通过APE1酶切割产生3’OH端，从而进行扩增，通过荧光染料能够检测到扩增产物，从而实现对hOGG1活性的检测。