[发明专利]鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

说明书

本发明属禽病学检测领域，本发明公开了一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该方法根据鸽腺病毒B型Fiber2基因组保守序列设计引物组：外引物(GXB‑F3和GXB‑B3)、内引物(GXB‑FIP和GXB‑BIP)和环引物(GXB‑LF和GXB‑LB)。具体序列分别见SEQ ID NO.1‑6。根据所设计的引物组建立一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该试剂盒检测方法与鸽常见传染病病原不发生交叉反应。本发明的检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，便于基层临床现场使用，方便快速。

技术领域

本发明属于禽病学检测领域，具体涉及一种鸽腺病毒B型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。

背景技术

人类养鸽历史悠久，鸽经驯化成观赏鸽、赛鸽和肉鸽，拥有较强的免疫系统，加上鸽舍多采用开放式或半开放式，空气流通好，空气新鲜，相比较其他畜禽，鸽生病较少。然而，随着养鸽业规模化、集约化的迅速发展，饲养总量、饲养密度的增加，鸽的饲养方式发生了改变，由于饲养管理水平低，疫病防治意识差，加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比赛)，鸽病也越来越多，越来越严重，越来越复杂。近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽业，据国内外研究，已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、鸽痘、鸽腺病毒感染、H9亚型低致病性禽流感、鸽Ⅰ型疱疹病毒感染、鸽轮状病毒感染和鸽圆环病毒感染等。腺病毒由于种类多，血清型复杂，宿主广泛，或作为主要的致病性病原或作为与其他致病性病原共感染的条件致病性病原，对养鸽业造成严重的威胁。禽腺病毒(Fowl aviadenovirus，FAdV)的血清2型、4型、5型、6型、8型、10型和12型均有在鸽群中检测到，有的血清型会引起鸽出现包涵体肝炎。鸽腺病毒A型(Pigeon aviadenovirus A，PiAdV-A)和鸽腺病毒B型(Pigeonaviadenovirus B，PiAdV-B)是不同于FAdV的腺病毒，虽然同属于禽腺病毒属(Aviadenovirus)，却是不同的病毒种。鸽腺病毒A型主要与幼鸽疾病综合征相关，幼鸽发病后出现呕吐，腹泻，食欲下降，甚至死亡。鸽腺病毒B型可以感染所有日龄的鸽子，其特征是引起鸽子猝死和广泛性肝炎坏死症。也有研究表明在出现呕吐、腹泻的鸽群的粪便中也能检测到鸽腺病毒B型。鸽腺病毒A型基因组大小为45480bp，鸽腺病毒B型的基因组大小为41981bp，两者的核苷酸同源性为54.9％，国际病毒分类委员会(The InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)已经将这两种病毒分类为不同的病毒种。虽然鸽腺病毒B型之前在国外有报道，但国内一直未见报道，近期我们从国内发病的鸽群中也检测到了该病毒的存在。

病毒分子生物学检测主要有常规PCR方法和实时荧光定量PCR方法，但由于实验设备要求比较高，在基层的检验检疫部门推广应用难。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是应用4-6条特异性引物，通过BstDNA聚合酶，在水浴锅中对靶基因进行的一种恒温扩增技术，该技术具有扩增特异性强、灵敏度高、操作快速简便、检测简单等特点，摆脱了对PCR仪、实时荧光定量PCR仪等昂贵仪器的依赖，在基层单位的检测更加方便。相对于现有的其他核酸扩增技术，LAMP具有许多独特的优点：①LAMP检测技术扩增的特异性很高，其特异性引物可以准确识别目的序列，对靶序列具有高度的选择性，减少了非特异性的扩增。②LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，减少了对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高，仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)，大大降低了检测的费用，特别适合基层和现场使用。③LAMP检测技术在阳性扩增反应中会产生大量的双链DNA混合物和白色焦磷酸镁沉淀，其扩增产物有多种检测方法，白色焦磷酸镁沉淀可通过浊度仪测定，双链DNA产物既可以通过琼脂糖凝胶电泳检测，也可以在反应体系中加入荧光染料，然后直接根据颜色的变化或者利用荧光照射装置进行紫外线照射进行分析。目前，还未见针对鸽腺病毒B型环介导等温扩增(LAMP)反应方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容