[发明专利]一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法

说明书

本发明提供了一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法。本发明利用小分子DNA环化效率与其结构柔性正相关的特点，将长片段DNA分子随机打断为短片段DNA后进行环化反应，通过测定其环化效率来对其结构柔性进行判定，进而对长片段DNA结构柔性进行表征。该方法完全摆脱了原子力显微镜的依赖，可以实现快速、高通量的测定，同时有效表征长片段DNA分子结构柔性，结果能够满足科学研究和技术优化等工作需求。

技术领域

本发明涉及一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法。

背景技术

在真核细胞内，DNA深度折叠压缩同组蛋白组成核小体，并形成染色体。DNA的这种特性使其成为一种非常理想的数据存储介质，以指导所有已知生物和许多病毒的生长、发育和繁殖。DNA分子的结构柔性直接影响了DNA分子和染色质的可折叠性，进而影响了染色质空间结构的形成和变化特征。染色质空间结构及其变化模式在基因的表达和调控上发挥了非常重要的作用，染色质的空间折叠可在空间上拉近启动子和增强子，使得基因表达得以更高效的调控。此外，由于DNA双螺旋分子处于高度动态的状态中，许多重要的生物过程都涉及DNA分子的弯曲和折叠，比如DNA复制、RNA转录以及其他蛋白与DNA分子的互作等，因此DNA分子的结构柔性对许多生物学功能的行使都至关重要。

目前，为了测定DNA分子结构柔性，人们用到了各种不同的表征方法，除了采用原子力显微镜进行扯拉观察和测量(Faas et al.2009；Mazur and Maaloum.2014)，人们也利用DNA分子的环化效率对DNA分子结构柔性进行表征(Du et al.2005)。原子力显微镜通常用于对长片段DNA分子结构柔性进行测定，而DNA分子的环化则应用于短片段DNA分子的测定，一般采用荧光能量共振转移FRET的方式测量。

原子力显微镜法通常过程繁琐，时间和经济成本均较高，且需要专用设备。而在大部分的科学研究和技术优化等工作中，我们仅需要对DNA分子的结构柔性的相对值进行测定和比较，DNA分子环化效率的测定就可以满足这一需求，但是现有的方法存在两个主要的限制：(1)仅对短片段DNA分子有效；(2)测定方法涉及凝胶电泳或荧光共振能量转移显微镜技术等，过程繁琐，对设备要求高。因此，开发快速、简便的DNA分子柔性表征方法可以更大地促进相关工作的进展。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法。本发明所述方法将长片段DNA分子随机片段化为短片段DNA后进行环化反应，通过荧光定量聚合酶链式扩增(RT-PCR)计算短片段DNA分子环化效率，继而表征长片段DNA分子结构柔性。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将长片段DNA分子随机片段化为短片段DNA分子；

(2)将步骤(1)得到的短片段DNA分子的两端分别连接接头序列；

(3)将步骤(2)得到的带有接头的DNA分子进行限制性内切酶酶切，产生黏性末端；

(4)使用连接酶对步骤(3)得到的带有黏性末端的DNA分子进行环化连接；

(5)根据步骤(2)得到的短片段DNA分子中的接头序列设计相向延伸引物对和背向延伸引物对，采用相向延伸引物对和背向延伸引物对分别对步骤(4)得到的DNA分子进行荧光定量PCR，得到背向延伸引物对荧光定量结果和相向延伸引物对定量结果；

(6)计算步骤(4)得到的DNA分子环化效率，通过步骤(4)得到的DNA分子环化效率来表征长片段DNA分子结构柔性，DNA分子环化效率为步骤(5)得到的背向延伸引物对荧光定量结果与相向延伸引物对定量结果之比，如计算得到的DNA分子环化效率越高，则长片段DNA分子结构柔性越高。

优选地，所述步骤(1)中长片段DNA分子长度为1000～2100bp。