[发明专利]组蛋白去甲基化酶LSD1的酶活检测体系、检测方法及应用

说明书

本发明提供了组蛋白去甲基化酶LSD1的酶活检测体系、检测方法及应用，包括过氧化氢荧光探针、LSD1的作用底物、黄素腺嘌呤二核苷酸或黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐，检测体系中过氧化氢荧光探针的浓度为3‑7μM，黄素腺嘌呤二核苷酸的浓度为3‑7μM，LSD1的作用底物的浓度为20‑30μM，荧光探针可以选择性地与组蛋白去甲基化酶作用后产生的副产物作用，生成一种具有荧光的物质，本发明解决了LSD1的酶活检测和抑制剂筛选过程中成本高和可重复性差，通量低，难以进行高通量药物筛选等诸多问题。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，尤其是涉及组蛋白去甲基化酶LSD1的酶活检测体系、检测方法及应用。

背景技术

表观遗传学是20世纪九十年代以来迅速兴起的科学。表观遗传是细胞在不改变DNA碱基序列的前提下改变了基因表达水平。真核细胞染色体由组蛋白与缠绕其上的DNA组成。组蛋白是真核细胞中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基的一种碱性蛋白质，它可与DNA分子之间紧密结合，对维持遗传物质的稳定存在发挥了至关重要的作用。同时，细胞对组蛋白上残基所进行的特定修饰作用也对基因的表达水平起到调控作用。

组蛋白上残基的修饰方式包括甲基化、乙酰化、泛素化以及SUMO化等。细胞通过对组蛋白进行这一系列的修饰，改变了基因的表达水平。它实现了细胞生命活动中的动态调节，在细胞生长周期、DNA损伤修复以及代谢水平调节等诸多过程中发挥了非常重要的调节作用。

组蛋白甲基化修饰是一种常见且重要的表观遗传学现象，它在细胞分裂分化、细胞衰老、DNA损伤修复、癌细胞产生发展等生理过程中发挥重要的作用。组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白赖氨酸和精氨酸残基上，最新也发现可发生在组氨酸和谷氨酰胺残基上。其中对赖氨酸和精氨酸甲基化修饰的产物较为稳定，因而成为生物体内最常见的甲基化修饰位点并承担重要的作用。如H3K4、H3K36和H3K79位点上的三甲基化修饰可作为促进基因表达的生物信号，同时与之形成对比的是H3K9me3、H3K27me3、H4K20me2等位点的甲基化修饰可抑制基因的表达。同样，即使组蛋白上甲基化修饰的位点相同，在甲基化修饰程度不同的情况下所带来的表观遗传效应也存在差异，这就使得生命体细胞可以对繁杂的代谢活动进行有序调节，使得其调控基因表达的方式上更具多样性。

组蛋白甲基化修饰受组蛋白甲基化酶和去甲基化酶协同调控。LSD1是最早发现的组蛋白去甲基化酶，具有与多胺氧化酶具有相似结构。LSD1在细胞分化，细胞增殖、转移扩散等多种生命过程中发挥重要的功能。已知乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌和前列腺癌等多种癌细胞中检测到LSD1的过量表达或激活的现象，因此LSD1酶活检测及抑制剂研究具有非常广阔的应用前景。

目前LSD1活性检测方法大致分为两种，一种是利用抗原抗体作用，直接检测一定时间内生成物的含量来测定酶活力；另一种则是通过测定一定时间内去甲基作用过程中产生副产物的量来间接反映酶活力的强弱。

第一种检测方法是利用抗原抗体检测方法。利用抗体与去除甲基后的多肽结合，最终通过测定吸光度或者荧光的方法确定产生结合作用的抗体总量，进而确定出一定时间内LSD1的作用效果。这种检测方法灵敏性高，可实现精确度较高的定量检测。然而实验者需要使用两种特异性抗体才能实施整个实验过程，实验成本较高。同时，在整个实验过程中还需经过多步清洗过程，步骤繁琐，耗时较长。不利于LSD1抑制剂药物的高通量筛选过程。