[发明专利]抑制疟原虫感染的单克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.抑制疟原虫感染的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，阳性克隆的获取：选用PfRH5蛋白序列的201-324aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-1，选用PfRH5蛋白序列的302-396aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-2；

S2，原核表达：

将两个阳性克隆菌种分别接种于含抗生素的LB培养基中培养，加入诱导物IPTG继续培养过夜，破碎大肠杆菌，将破碎的菌液离心，分别收集上清和沉淀；

S3，纯化重组蛋白：

收集的上清用0.22μm滤膜过滤后过柱，收集目的蛋白PfRH5-1-GST和PfRH5-2-GST，洗脱后透析，然后浓缩至1mg/mL，即为抗原；

S4，免疫小鼠：连续进行三次免疫，每次间隔22天，第三次免疫后10天，检测免疫小鼠抗体效小鼠尾尖采血，选取抗体效价较高的小鼠进行加强免疫，加强免疫抗原用量为48-50μg/只，尾静脉注射，180-200μl；

S5，制备融合细胞：取正常小鼠，制备脾细胞悬液进行培养；

S6，收集免疫后小鼠脾细胞：获取免疫后的小鼠脾细胞，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液重悬混匀，裂解红细胞后计数；

S7，融合培养和单克隆筛选；

S8，杂交瘤细胞培养，获得单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述的两个阳性克隆菌种培养条件均为37℃，250rpm，所述的LB培养基中抗生素的终浓度为100g/mL。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中，透析液为PBS，透析时间为12h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，三次免疫具体为：首次免疫抗原量为100μg/只，皮下多点注射，共200μl；第2-3次免疫，抗原量为100μg/只，皮下多点注射，共200μl。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S5中，脾细胞悬液培养时，调整细胞密度为1×10⁵个/ml，加入96孔板，100μl/孔，于37℃、5％CO₂培养箱培养。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S7中，融合培养和单克隆筛选的具体过程为：取10⁸细胞备用做融合，按SP2/0细胞：脾细胞以1:10的比例混合离心获得细胞沉淀，预热，吸取1ml预热至37℃的PEG加入细胞沉淀中，混合均匀，37℃水浴静止60s，加HAT培养基终止反应，将含融合细胞的HAT培养基接种于含饲养层细胞的96孔培养板中，100μl/孔，37℃、5％CO₂培养箱培养，密度占孔1/3时进行单克隆筛选，选高效价融合阳性孔。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S8中，杂交瘤细胞培养的具体过程为：选用10周龄小鼠，腹腔接种不完全佐剂，每只小鼠0.5ml，腹腔注射用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，注射细胞数量为2-3x10⁶个/只，间隔7-10天后，采集腹水，离心、收集上清、纯化后获得单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2。

8.根据权利要求1所述的制备方法制备获得的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括抗体PfRH5-1和抗体PfRH5-2。

9.如权利要求8所述的单克隆抗体在制备抑制或检测恶性疟原虫感染的药物中的应用。

10.如权利要求8所述的单克隆抗体在制备抑制恶性疟原虫感染的药物中的应用，其特征在于，所述感染的对象为红细胞。