[发明专利]一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法。所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。所述检测方法包括：提取DNA作为反应的模板；采用所述的引物和探针进行实时荧光PCR检测。本发明通过设计一组葡萄座腔菌特异性引物和探针，并对反应体系进行了优化，建立了针对该菌株实时荧光定性检测的方法，能够在受到单一病原菌或复合侵染的样本中检测出该病原真菌。

技术领域

本发明涉及海关检验检疫技术领域，特别是涉及一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

葡萄座腔菌属真菌寄主范围广泛，不仅存在于土壤中也作为内生真菌寄生于健康植株，遇到适宜环境条件便侵染植株引发病害，导致植株发生枯萎、腐烂和溃疡等病害。苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)，属于葡萄座腔菌属，鉴于其对国内果蔬生产安全的危害性，已列入我国进境检疫性有害生物名录，属于口岸重点关注检疫病害。

口岸对病原菌的准确、快速检测鉴定是防范该病原菌入侵危害的重要基础，然而利用传统的病原菌分离方法对病样进行分离鉴定，需要消耗大量时间，同时要求鉴定人员具备专业的病原菌鉴定技能。葡萄座腔菌可用于分类的有性态特征较少，且很难用培养基培养，因此目前鉴定葡萄座腔菌主要根据其无性态特征来进行鉴定，但是该属真菌无性态特征不稳定，容易受环境条件的影响。因此，开发一种对该类真菌快速、准确的检测方法，对病害的管控具有重要的意义。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供了一种快速、准确的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法。

在本发明的一方面，提供一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组，所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQID NO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，前述的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组中，其中所述探针的5'端修饰有荧光报告基团5`6-FAM、5`HEX或5`VIC；3'端修饰有含有不发荧光的淬灭基团3`BHQ1、3`BHQ2或3`BHQ3。

在本发明的另一方面，提供一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其包括上述的引物探针组。

进一步地，前述的实时荧光PCR检测试剂盒中，其中还包括2×Taqman ExpressPCR Master Mix和1-2μg/ml的阳性对照。

进一步地，前述的实时荧光PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物、下游引物、探针以引物探针混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。

进一步地，前述的实时荧光PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L，探针的工作浓度为10μmol/L。

在本发明的另一方面，提供一种不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

S1.提取DNA作为反应的模板；

S2.采用所述的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法中，其中步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括：

1)采集待测样本：将待测样本充分研磨至粉末状，加TE缓冲液稀释后，得到研磨液；