[发明专利]一种适用于拟茎点霉FS508的过表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种适用于拟茎点霉FS508的过表达载体及其构建方法和应用。本发明在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次构建了适用于深海真菌拟茎点霉FS508的次级代谢产物生物合成基因的过表达载体，为促进lithocarpins在抗肿瘤先导化合物的应用及其他丝状真菌次级代谢生物合成基因的过表达及活性次级代谢产物生物合成效率的提升奠定了可靠的分子生物学基础。

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种适用于拟茎点霉FS508的过表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

深海真菌由于其特殊生境及复杂的基因组能产生骨架新颖、生物活性独特的化合物，本发明前期从深海真菌拟茎点霉FS508(Phomopsis lithocarpus FS508)中分离获得了一系列tenellone杂合十元大环内酯的新骨架聚酮类化合物lithocarpins，且这类化合物具有显著的抗肿瘤活性。在此基础上，对P.lithocarpus FS508进行了基因组测序，预测了lithocarpins的生物合成基因簇，并从中发掘了新型的具有酰基转移和氨基转移活性的GPAT酶，预测GPAT基因是lithocarpins类化合物生物合成的关键基因。而P.lithocarpusFS508中lithocarpins生物合成效率较低。因此有必要对其采取基因工程改造以提升lithocarpins的产量，为抗肿瘤药物先导化合物的开发奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于深海真菌拟茎点霉FS508(P.lithocarpusFS508)的过表达lithocarpins生物合成基因GPAT基因的载体及其构建方法和应用。

本发明前期从深海真菌P.lithocarpus FS508中分离得到了新骨架聚酮类化合物lithocarpins，且其具有显著的抗肿瘤活性。本发明构建了适用于P.lithocarpus FS508的过表达载体，将GPAT基因插入至过表达载体，然后将重组载体通过PEG介导转化至P.lithocarpus FS508原生质体中，以提高GPAT基因的表达水平，从而提升lithocarpins类化合物的产量。为后期解析P.lithocarpus FS508中lithocarpins的生物合成途径及其开发作为抗肿瘤药物先导化合物奠定分子生物学基础。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种提高拟茎点霉FS508中抗肿瘤化合物lithocarpins产量的方法，是在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选，是将GPAT基因插入到表达载体中，然后转化至拟茎点霉FS508中进行过表达。

进一步优选，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBARGPE1-Hygro(该载体序列为公知，具体可查询网址www.miaolingbio.com)，根据酶切后的pBARGPE1的序列和GPA T序列，设计GPAT引物PBGPE1-GPAT-F：5’-gataagcttgatatcgatggcaaaaggggccg-3’，PBGE1-GPAT-R：5’-gactctagaggatcTCAGTGGTGGTGGTGGTG-3’，扩增GPAT基因片段，利用同源重组的方法将GPAT基因片段构建到已酶切的质粒pBARGPE1，构建pBARGPE1-GPAT载体，然后将pBARGPE1-GPAT载体通过原生质体转化法导入拟茎点霉FS508原生质体中。

本发明的第二个目的是提供产lithocarpins的工程菌株，其是在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因而获得的工程菌，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种适用于拟茎点霉FS508的pBARGPE1-GPAT载体的构建方法，其包括以下步骤：其是将GPAT基因插入到pBARGPE1载体中。