[发明专利]一种获得高含量亚油酸水稻株系的方法

说明书

本发明公开了一种获得高含量亚油酸水稻株系的方法，过程包括：在水稻ω‑3脂肪酸去饱和酶基因FAD3.1、FAD3.2cDNA高度一致的区域设计靶位点，将任一gRNA片段与AarI‑Cas9‑PC1300载体连接，得到基因编辑载体F AD3‑S‑PC1300；将得到的基因编辑载体FAD3‑S‑PC1300通过农杆菌侵染水稻，对水稻进行基因编辑，得到FAD3突变体；分析FAD3突变体的基因型，并对FAD3双突变体水稻中脂肪酸含量进行测定，同时观察籽粒主要农艺性状，得到了不改变主要籽粒农艺性状高亚油酸含量的水稻基因型。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种获得高含量亚油酸水稻株系的方法。

背景技术

亚油酸(十八碳二烯酸)具有保护心脑血管的功效。可以软化人类的心脑血管也能加快身体内血液循环，可以降低血压与血脂，加快人体新陈代谢，效预防多种疾病，延缓衰老。亚油酸是人体必需的一种脂肪酸，它能加快体内脂肪代谢与分解，减少胆固醇在血管壁上形成积存，能有效预防动脉硬化发生。亚油酸还能提高人体免疫力，也能促进骨骼发育，更能提高记忆力，预防脑部功能退化。

米糠是稻谷加工过程中的副产品，可用压榨法或浸出法制取的一种稻米油。米糠油含有38％左右的亚油酸和42％左右的油酸，其亚油酸与油酸的比例约在1：1.1。水稻中亚油酸转化亚麻酸主要由ω-3脂肪酸去饱和酶(FAD3.1，FAD3.2)催化合成。随着基因编辑技术的迅速兴起，使得各种Cas9变体、基因定点突变、单碱基替换等各种基因编辑手段和方法对植物合成途径的精准控制成为可能，因此，如果可以将ω-3脂肪酸去饱和酶基因敲除，就可阻断亚油酸向亚麻酸转化。

因此，如何提供一种获得高含量亚油酸水稻株系的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种获得高含量亚油酸水稻株系的方法，该方法通过阻断水稻中亚油酸转化亚麻酸的途径，达到提高水稻中亚油酸含量的目的。

一种获得高含量亚油酸水稻株系的方法，其特征在于，以CRISPR-Cas9系统中任一gRNA片段同时对水稻中ω-3脂肪酸去饱和酶基因FAD3.1、FAD3.2进行敲除，所述gRNA片段为FAD3.1、FAD3.2基因cDNA区域的部分碱基序列，过程包括：

1)在水稻ω-3脂肪酸去饱和酶基因FAD3.1、FAD3.2 cDNA高度一致的区域设计靶位点gRNA，即含有PAM结构前20个碱基，将得到的gRNA片段与AarI-Cas9-PC1300载体连接，得到基因编辑载体FAD3-S-PC1300；

2)将步骤1)得到的基因编辑载体FAD3-S-PC1300通过农杆菌侵染水稻，对水稻进行基因编辑，得到FAD3突变体；

3)分析FAD3突变体的基因型，并对FAD3双突变体水稻中脂肪酸含量进行测定，同时观察籽粒主要农艺性状，得到了不改变主要籽粒农艺性状高亚油酸含量的水稻基因型。

以上技术方案达到的技术效果是：本发明通过一个gRNA打靶两个高度一致的基因，通过一次基因转化敲除两个基因FAD3.1和FAD3.2，阻断了水稻中亚油酸转化亚麻酸的途径，提高了水稻中亚油酸的含量，较阻断之前，亚油酸含量提高了3.36个百分点。

作为本发明优选的技术方案，所述gRNA序列包括gRNA1或gRNA2；所述括gRNA1的引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；所述gRNA2的引物如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示。

作为本发明优选的技术方案，所述载体主要由CaMV35S驱动的Cas9和OsU3启动子驱动的RNA表达系统构成的植物基因表达载体在OsU3启动子后中两个背靠背的AarI位点构成。