[发明专利]蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：

a、蓝舌病毒1型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACAGGCACAGTCCACTTACG 3’；下游引物：5’ CATCTCGCGTGCAATCTTGG 3’；扩增片段长度为：700 bp；

b、蓝舌病毒16型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACTGACGGAGCCAGAGGAT 3’；下游引物：5’ TGACGTGGTATCCGCTTTCC 3’；扩增片段长度为：367 bp；

c、如a或b所示的核苷酸序列经替换、删除或增加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与a和b所示核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

2.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：合成上述蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因的引物组；

步骤2：制备阳性对照和阴性对照：阳性对照为分别携带有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因的质粒，由生物公司合成；阴性对照为去离子水；

步骤3：制备待测样品：提取待测样品的RNA,经反转录为cDNA后进行PCR扩增；

步骤4：分别以上述cDNA、阴性对照和阳性对照为模板，配制PCR反应体系，即将步骤2，3中所得DNA溶液加入到PCR反应体系中，分别加入2种引物组进行PCR扩增；反应体系如下：

2×Es Taq MasterMix 12.5 μL；

引物p1（100 pmol/L） 0.5 μL；

引物p2（100 pmol/L） 0.5 μL；

模板DNA 2 μL；

加ddH2O至25 μL；

反应条件为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性30 sec，61℃起第5个循环开始每个循环降低0.2℃退火30 sec ，72℃延伸30 sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后12℃，保存；

步骤5：取出5-10 μL的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，凝胶成像仪照相分析，与DNA Marker电泳条带进行比对判断出扩增条带的大小，将阳性对照与待测样品进行比对，即当样品中有蓝舌病毒1型存在时，在700 bp附近出现特异性条带，当样品中有蓝舌病毒16型存在时，在367 bp附近出现特异性条带。