[发明专利]CD155基因人源化的非人动物的构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种CD155基因人源化的非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人CD155蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人源化CD155蛋白，可以作为人CD155信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种人源化CD155蛋白、一种人源化CD155基因、一种CD155基因的靶向载体，以及上述构建方法获得的非人动物及其在生物医药领域的应用。

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CD155基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

CD155，又称PVS、HVED、NECL5、TAGE4或Necl-5，是Nectin-likeI型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族下的PVR-related（PRR）家族，是一种促进细胞结合的黏附蛋白，可以与脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，简称PV）结合并使其进入易感细胞，所以更常被称PVR（Poliovirus Receptor，脊髓灰质炎病毒受体）。CD155在单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、CD34+胸腺细胞和神经元均检测到表达，但其在大部分肿瘤细胞中高表达，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等。研究表明，CD155在介导恶性肿瘤的转移中发挥了重要作用。CD155除了作为PV和巨细胞病毒的受体外，还通过与CD96、Nectin 1-3（CD111、CD112、CD113）、CD226等相互作用，参与细胞与细胞、细胞与基质的粘附。NK细胞上表达一些可结合Nectins（结合素）和Nectin-like family（结合素样家族）的黏附蛋白，在调节NK细胞功能起到重要作用。其中包括TIGIT、CD226和CD96等受体，CD155是TIGIT、CD226、CD96的共有配体，CD226是CD155共刺激受体，而TIGIT和CD96为CD155的共抑制受体，通过复杂的受体/配体以及受体/受体平衡调控机制，实现NK细胞和T细胞的激活或者抑制。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。但是，并不是任何基因或者替换任何基因的任何区域，都可以成功实现人源化动物模型的制备。在该领域，最重要的也是最具挑战性的是根据实际需求，对特定非人动物基因的特定序列，选择相应人源基因的特定区域进行插入或替换，从而获得可以表达人源化蛋白且具有抗体筛选等功能的人源化动物模型。

因此，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上CD155基因的复杂性，例如，人和小鼠CD155蛋白的一致性仅59%，且小鼠的CD155蛋白不结合人CD226，而人CD155蛋白可结合鼠的CD226，加之CD155与CD96、Nectin 1-3（CD111、CD112、CD113）、CD226等蛋白之间复杂的配体-受体以及受体-受体调控机制，本申请提供了一种CD155基因人源化的非人动物的构建方法，选择特定的人CD155基因的部分区域替换特定的动物CD155基因的部分区域。

发明内容