[发明专利]一种宏基因组来源的木聚糖酶及其编码基因

说明书

本发明公开了一种宏基因组来源的木聚糖酶编码基因及其高效表达和产物分离纯化方法。本发明人从造纸废水宏基因组文库中克隆到了一个木聚糖酶基因，该基因在大肠杆菌中表达的产物木聚糖酶能水解木聚糖。表达的粗酶经Ni磁珠法一步分离纯化后，在最适条件pH 7.0，60℃下比活力为438.4U/mg。经酶学性质研究发现该酶在pH 5.0～8.0之间均具有较好的活力，在65℃保温60min后酶活力保持75％以上。该酶pH适应范围宽，热稳定性好，可很好地满足工业生产的需要。

技术领域

本发明涉及一种宏基因组来源的的木聚糖酶编码基因，其高效异源表达及所表达酶的应用，属于生物技术领域。

背景技术

木聚糖酶是一组酶，而非单一的酶。木聚糖的酶法降解首先要去除木聚糖的侧链，然后再分解木聚糖的主链，降解过程中需要多种酶的协同作用，碳水化合物酯酶参与侧链的去除，木聚糖酶则参与主链的水解。木聚糖酶通过断裂木糖苷键水解木聚糖，释放木糖和低聚木糖，其中β-1,4-木聚糖内切酶在木聚糖的水解过程中起主要的作用。

低聚木糖也称木寡糖，由2～7个木糖单元连接组成，在功能性食品和医药行业中具有广泛的应用：低聚木糖能够促进双歧杆菌的生长，从而产生的短链脂肪酸降低肠道pH值，抑制有害菌生长，因此，低聚木糖具有调节肠道菌群的作用，此外，低聚木糖耐酸耐热，在pH较低的胃液环境中仍能稳定存在，低聚木糖可以抑制癌前病变的发展，促进机体对钙、铁等矿物质的吸收，促进机体生成多种营养物质，改善宿主健康状况；在饲料工业中，低聚木糖不仅能促进家禽生长，并且具有免疫调节作用，是一种安全有效的饲料添加剂。目前，市场上酶解法制备的低聚木糖以木二糖至木五糖为主，其中木三糖和木四糖效果最好，商业价值最高。

低聚木糖可由丰富廉价的可再生资源(麦秆、秸秆、玉米芯、棉籽壳、稻壳等富含木质纤维素的农林废弃物)制备。目前由木质纤维素制备低聚木糖的方法主要有酸解法、热水抽提法、微波法和酶解法。非酶处理的热化学制备过程通常会产生糠醛等副产物，从而降低了低聚木糖的产率，也给后续分离纯化造成困难，且物理化学处理难以控制木聚糖的降解度和产物的分子量。酶法处理可解决这一难题，通过控制酶量、水解温度和水解时间等条件可制备所需分子量的低聚木糖。

木聚糖酶在造纸、纺织、食品工业中也具有广泛的应用。在造纸工业中，木聚糖酶不但能够降低纸浆的卡帕值，提高纸浆的亮度，在纸浆漂白过程中起到促进漂白的作用，而且能减少二氧化氯等化学剂的使用，降低漂白废水中有害物质的产生，节约废水处理的成本；在纺织工业中，使用木聚糖酶能够降解棉花种皮碎片的木质纤维素，具有生物脱胶的作用，不但对织物的漂白等步骤具有促进作用，而且减少了化学试剂的使用，降低了漂洗所用水量；在食品工业中，木聚糖酶能够改善面团的稳定性，将木聚糖酶处理过的面团用于烘焙，能够降低面包的硬度，增大面包的膨胀率，使烘焙所得的面包具有更好的口感。

由于木聚糖酶广泛的工业应用，木聚糖酶已经受到了许多关注。大多木聚糖酶的最适温度为40℃～55℃，最适pH为3.0～10.0，且这些木聚糖酶的热稳定性较差，但是，在工业应用中往往需要木聚糖酶具有良好的耐热性，因此，仍然需要挖掘新的具有优良耐热性能的木聚糖酶。

木聚糖酶基因主要来源于真菌和细菌。已有许多研究从白蚁肠道、沼气池等环境中分离出具有木聚糖酶活性的菌株，但是有许多微生物不可分离培养，或者分离培养成本高。宏基因组技术在环境中直接获取微生物组DNA，在短时间内鉴别出大量的潜在酶基因，避免了微生物分离培养这一步骤，不仅省时，省事，还能节约成本。虽然现在已有许多研究通过宏基因组手段筛选木聚糖酶基因，但是，不同环境中微生物所产生的木聚糖酶在活性、稳定性、底物专一性等方面具有明显差异。例如，从酸性废水中获得木聚糖酶基因具有酸稳定性，从碱性废水获得的木聚糖酶具有嗜碱性。从不同环境中获得新的优良的木聚糖酶基因尤为重要。现今，已有报道在造纸厂废水中获得具有木聚糖酶的菌株，但是，利用宏基因组技术挖掘表达造纸厂废水的木聚糖酶基因的相关报道只有一篇，Yanyu Zhao等人从造纸厂废水污泥中表达出一条具有木聚糖酶酶活的基因，但是表达出来的木聚糖酶的酶比活不高，只达到84.93U/mg。

发明内容