[发明专利]一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，公开了一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法，以溶血磷脂为原料，以金属离子螯合剂处理的pfGDPD为催化剂，在水相体系中水解溶血磷脂，得到甘油磷酸二酯产物；所述pfGDPD的氨基酸序列为SEQID No:1。本发明从溶血磷脂出发，通过单一酶法水解一步可制备获得高纯度的甘油磷酸二酯(如GPC,GPE,GPI等)，转化率接近100％。本发明为甘油磷酸二酯的生产提供了一种新的思路和方法。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种利用酶法获得高纯度催化产物甘油磷酸二酯的方法。

背景技术

甘油磷酸二酯，是人体内正常存在的水溶性小分子物质。常见的有甘油磷脂酰胆碱(GPC)、甘油磷脂酰乙醇胺(GPE)、甘油磷脂酰肌醇(GPI)等。甘油磷酸二酯是磷脂代谢的产物并在人体内发挥重要的生理功能。以GPC为例，在体内，GPC最重要的生理功能在于穿过血脑屏障，为乙酰胆碱和磷脂(PC)的合成提供必要的胆碱源。临床研究表明:GPC治疗脑缺血性中风、阿尔茨海默氏症、多发性脑梗死型痴呆疗效显著。临床用于改善中毒性肝损伤等保肝作用；同时，GPC还具有显著的防衰老、降血脂、健脑等多种功效，作为保健品及药物制剂的研究与应用正越来越受到重视，开发高纯度甘油磷酸二酯制备方法具有重要价值。

目前，甘油磷酸二酯的的制备方法主要有3种:①生物组织直接萃取法，该方法工艺复杂，得率低，成本高；②从卵磷脂水解制备:此方法工艺简单，成本低，但后处理相当繁琐，产品纯度低，尤为重要的是无法解决环保问题。③化学法合成:从基本化工原料制备，但步骤繁多，工艺复杂，且收率较低。以D-甘露糖醇为原料进行一系列反应制备甘油磷酸胆碱为例，其收率仅为38.6％(率以D-甘露醇计)。因此，急需开发新的制备方法，提高产物纯度，并降低生产成本，简化生产程序，从而促进甘油磷酸二酯的广泛应用。

甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD；EC 3.1.4.46)是一类催化甘油磷酸二酯的3′–5′磷酸二酯键水解的酶。发明人在前期研究(Wang FH,Lai LH,Liu YH,Yang B,Wang YH*.Expression and Characterization of a Novel GlycerophosphodiesterPhosphodiesterase from Pyrococcus furiosus DSM 3638 That PossessesLysophospholipase D Activity.Int.J.Mol.Sci.2016,17(6),831.)中成功构建了来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(pfGDPD)的大肠杆菌重组表达菌株及酶蛋白的制备方法，该酶除了水解甘油磷酸二酯底物外，还能水解溶血磷脂底物。但在水解溶血磷脂底物的实验中会产生甘油磷酸二酯(如GPC，GPE，GPI等)和溶血磷脂酸(LPA)两种产物，在甘油磷酸二酯的高纯度制备方面的应用仍不理想。

发明内容

本发明基于实验所发现的pfGDPD具有水解酯键的特性，提出一种全新的甘油磷酸二酯制备方法，从溶血磷脂出发，通过单一酶法水解一步可制备获得高纯度的甘油磷酸二酯(如GPC,GPE,GPI等)，转化率接近100％。

本发明的技术方案如下：

一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法，以溶血磷脂为原料，以金属离子螯合剂处理的来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(pfGDPD)作为酶催化剂，在水相体系中水解溶血磷脂，得到甘油磷酸二酯产物；其中，pfGDPD的氨基酸序列为SEQID No:1，其核酸序列为SEQID No:2。具体方法是将溶血磷脂底物溶于pH8.0的缓冲溶液中，在温度为30-90℃的条件下，向反应体系中加入用金属离子螯合剂处理后的pfGDPD，进行酶解反应，制得高纯度甘油磷酸二酯。

优选地，缓冲溶液为硼酸缓冲液。