[发明专利]黑胫病菌胁迫下烟草microRNA检测方法

权利要求书

1.黑胫病菌胁迫下烟草microRNA检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)称取烟草茎部样品50mg至液氮中研磨；

(2)加600uL溶解液继续研磨，直至溶解；

(3)转移匀浆至小管，离心力14000Xg，室温条件下离心处理2min；

(4)取上清液，加一倍水相70％乙醇，涡旋混匀；

(5)取600uL含乙醇的水相到柱子上，离心力14000Xg，室温条件下离心处理1min；

(6)去下游液体，加400uL洗液到柱子上，离心力14000Xg，室温条件下离心1min，去下游液体，重复此步骤两次，完成第一次清洗；

(7)配制DNase I混合液：取1uL DNase I稀释至5uL，取1uL稀释液，加入5uL DNase I缓冲，44uL无菌水，用枪头吹打混匀；

(8)步骤(6)第一次清洗之后，在柱子上加入步骤(7)配制好的DNase I混合液，离心力14000Xg，室温条件下离心1min,转移下游液体到柱子上，室温放置15min；加400uL洗液到含DNaseⅠ的柱子上，放置1min,离心力14000Xg，室温条件下离心1min,弃下游液体，重复一次，完成第二次清洗；

(9)离心力14000Xg，室温条件下空离2min；

(10)将柱子转移到提供的1.5mL收集管，加50uL RNA洗脱液到柱子上，离心力200Xg离心2min，室温；离心力14000Xg离心1min，室温；将柱子转个方向，室温，离心力14000Xg离心1min；

(11)检测RNA质量，样本储存于-80℃，长期保存；将提取的RNA样品在冰上融化后，离心并充分混匀，取1uL样品使用无酶水按一定比例稀释后，70℃变性2min，运用安捷伦生物分析仪检测RNA的纯度和完整性。

2.根据权利要求1所述的黑胫病菌胁迫下烟草microRNA检测方法，其特征在于：所述烟草茎部样品采用以下步骤处理获得：

(1)将烟草种子依次进行75％乙醇45s、5％次氯酸钠8min浸泡和无菌水冲洗处理；

(2)播种于育苗棚漂浮盘中，育苗基质采用高温高湿灭菌处理；

(3)待烟草长至8～10片真叶期时，转入昼夜温度分别为30℃和25℃、光暗时间比为12/8，湿度≥70％的人工气候箱中，适应性培养7d；

(4)采用人工茎基部注射接种黑胫病生理小种孢子悬浮液，每株接种5ml，取茎基部以上1cm组织样品1g，对所取样品进行无菌水清洗，然后灭菌纸檫干，迅速用液氮冷冻样品并将其放入-80℃超低温冰箱保存，完成烟草茎部样品的制备。

3.根据权利要求2所述的黑胫病菌胁迫下烟草microRNA检测方法，其特征在于：所述黑胫病生理小种孢子悬浮液采用以下步骤制备：

(1)将分离纯化的烟草黑胫病生理小种在燕麦培养基上培养21d，得到菌丝；

(2)用0.1％KNO₃和1％葡萄糖混合液浸泡所述菌丝，并放入26℃恒温箱培养72h，再将其置于8℃冰箱中处理20min取出，室温下10～30min有大量游动孢子释放，过滤，镜检，调整游动孢子的浓度为1×10³～1×10⁴个/ml。

4.根据权利要求3所述的黑胫病菌胁迫下烟草microRNA检测方法，其特征在于：所述的燕麦培养基的组份按重量百分数计，包括：燕麦片30g，琼脂粉15g，去离子水1000ml。

5.根据权利要求1所述的黑胫病菌胁迫下烟草microRNA检测方法，其特征在于：所述的检测方法使用联川生物公司提供的TRK1001试剂盒提取抗病材料和感病材料的组织样品RNA。

6.根据权利要求1所述的黑胫病菌胁迫下烟草microRNA检测方法，其特征在于：所述步骤(5)水相较多时，重复操作步骤(5)。