[发明专利]一种核酸测序方法

说明书

本发明提供一种核酸测序方法，包括提供有聚合酶，所述聚合酶通过可断裂基团与dNTP连接，并且，所述的聚合酶可发出光信号；使所述聚合酶与待测核酸模板‑引物复合体的引物3'端接触，所述聚合酶上的dNTP与待测核酸序列上的碱基互补配对并在聚合酶酶促反应加入引物3'端；检测所述聚合酶发出的光信号。随后dNTP与聚合酶断裂，聚合酶离开后新的模板‑引物复合体可以进入下一个测序循环。本发明所述的核酸测序方法可以实现对核酸序列快速的测定。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种核酸序列的测定方法。

背景技术

DNA(脱氧核糖核酸)是组成生物体的遗传物质，由不同排列顺序的A、T、C、G组成，这些由不同顺序的A、T、C、G组成的遗传物质蕴含着丰富的遗传信息以及生命内涵。通过核酸测序技术可以获取不同遗传物质的核酸序列，帮助人们了解个体遗传物质之间的差异，这对生命科学研究、疾病诊断、个性化用药等均具有十分重要的意义。

第一代测序技术以Sanger发明的双脱氧链末端终止法为代表，该方法成本高，速度慢，通量低等不足，不能满足研究及应用的需求。第二代测序技术中Illumina公司的Solexa测序技术成本相对较低，所以被广泛的应用，但是该技术从开始建库到完成测序需要6天的时间，耗时较长。第三代测序技术中Pacific Bioscience公司的SMRT是唯一商业化应用的技术，SMRT技术实现了单分子测序，具有不需要扩增，读长长等优势，虽然该技术相对于Solexa测序技术从建库到完成测序时间短了一些，但是仍需约两天时间才能完成。

专利US5302509描述了一种对多核苷酸模板测序的方法，该方法包括使用DNA聚合酶或DNA连接酶连续掺入与模板链互补的经标记核苷酸或多核苷酸而实施的多延伸反应。在这种“合成测序(sequencing by synthesis)”反应中，通过连续掺入与模板链互补的单个核苷酸以5'到3'的方向构建了一条与模板链碱基配对的新核苷酸链。将测序反应使用的核苷三磷酸底物封闭以防止过度掺入，差异标记核苷三磷酸底物以使得能够确定作为后续核苷酸被加入的掺入核苷酸的种类。

专利CN106244712A公开了一种DNA测序方法，包括如下步骤：(1)在待测DNA的3'末端增加标签序列，形成含有标签序列的待测DNA；所述标签序列的核苷酸序列与测序引物的核苷酸序列反向互补；(2)将所述含有标签序列的待测DNA和所述测序引物混合，形成5'末端双链主体单链形式的产物；(3)完成步骤(2)后，将产物分别与dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四个体系，分别将每个体系加入特异DNA聚合酶修饰的单分子器件，读取电信号。实验证明，采用本发明提供的方法可进行DNA测序，具有重要的应用价值。Illumina的测序技术的核心的合成酶链伸反应(Sequencing by synthesis)是一个三个底物的反应，主要包括模板-引物杂交体、dNTP、DNA合成酶，反应动力学是二级反应；本发明提供的方法以dNTP-DNA合成酶和可逆连接复合物为反应底物，与模板-引物杂交体反应，反应动力学是一级反应，因此比Illumina的SBS技术速度更快。此外，Illumina的SBS荧光分子连接在dNTP的碱基上，通常只有一个荧光分子，因此光学信号强度有限；本发明提供的方法在合成酶上连接荧光分子，可以提供更多的连接位点，连接一个以上的荧光集团，因此可以提高光学信号强度。

WO2007076057A2提供了含有具有改善核苷酸类似物进入活性位点区和在活性位点区与核苷酸类似物协调作用的特征的聚合酶的组合物。也提供了制备这种聚合酶和将这种聚合酶用于测序以及DNA复制和扩增的方法，以及聚合酶活性的动力学模型和使用此模型的计算机实现方法。