[发明专利]用于裸鲤棘头虫的检测鉴定方法

说明书

本发明提供了一种用于裸鲤棘头虫的检测鉴定方法，包括如下步骤：根据形态特征，采集鱼类宿主中的裸鲤棘头虫；提取虫体样本的DNA；进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取DNA的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行PCR扩增；将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为裸鲤棘头虫。该鉴定方法具有实验结果准确可靠的优点。

技术领域

本发明属于传统形态学与分子生物学检测相结合进行鉴定的技术领域，具体涉及一种用于裸鲤棘头虫的检测鉴定方法。

背景技术

裸鲤棘头虫(Echinorhynchus gymnocyprii)隶属于古棘头虫纲(Palaeacanthocephala)棘吻目(Echinorhynchidea)棘吻科(Echinorhynchidae)棘吻虫属(Echinorhynchus)，是寄生于西藏土著鱼类的寄生蠕虫。其吻部较长，其上密布吻钩，在鱼类消化道中靠吻钩钻入宿主肠黏膜寄生，破坏宿主肠壁，引发炎症，大量寄生可导致肠穿孔，因其体型较大，容易引起肠道堵塞，造成宿主死亡。

渔业发展伴随着与鱼类各种疾病的抗争，必须对所感染的寄生虫做出准确鉴定，才能够制定合理有效的治疗方案，这是水产养殖业持续健康发展的基础和前提。形态鉴定是寄生虫鉴定的常用方法，但同属的寄生虫在形态上往往较为相似，仅通过形态鉴定并不能完全保障对种鉴定的准确率，需要辅以分子生物学的方法加以验证。

目前裸鲤棘头虫还没有特异性引物用于分子生物学鉴定，而通用引物是针对某个科或某个属已知种类的某个基因的碱基序列高度保守的区域设计的，因而采用通用引物进行测序就可能出现同属不同种间的测序结果一致性达到99%以上的情况，根据这个结果将不同种判定为同种，出现鉴定错误。也就是说，采用通用引物鉴定不能完全有效并准确的区分物种，物种无法确定，有针对性的保护和防治工作也无法顺利开展。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于裸鲤棘头虫的检测鉴定方法，该鉴定方法具有实验快结果准确可靠的优点。

本发明采用的技术方案是：

一种用于裸鲤棘头虫的检测鉴定方法，包括如下步骤：

A、根据形态特征，采集鱼类宿主中的裸鲤棘头虫；

B、提取虫体样本的DNA；

C、进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取DNA的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行PCR扩增；

D、将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为裸鲤棘头虫。

本发明所述裸鲤棘头虫的形态特征，体色鲜艳，以各种黄色居多，也有白色、暗红色，偶见黄色底色，体表带橙色环状花纹的个体，体壁较厚。吻端位，较长，呈圆柱形；吻钩13列，每列9个，第1个略小，2~6个等大且最大，后3个小于前面6个，后2个又小于倒数第3个，全部带有根部；吻鞘较深，呈棒状；吻腺短而粗，呈棒状，与吻鞘长度相近。雌虫体腔内可见椭圆形卵，分散排布。雄虫的2个睾丸相连，呈椭圆形，基本等大；黏液腺位于睾丸后侧，6个，呈倒梨形；雄虫交接囊可伸出体外，呈钟罩状。

本发明所述虫体样本的采集方法，刮取鱼类消化道的内容物和粘液，置于玻璃板中，并用同样大小的玻璃板挤压，使内容物和粘液分散展开，采用便携式解剖镜观察虫体形态并采集裸鲤棘头虫。

优选地，所述玻璃板的大小为10*10cm，大小适于所使用的便携式解剖镜。

本发明采用18S特异性引物和COX1特异性引物分别进行PCR扩增，得到的PCR产物经序列比对一致性均达99%以上即可确认。

优选地，所述18S特异性引物为：

上游引物： GTTCATCGTTGATGCACTTCAG