[发明专利]一种检测核因子-κB的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供一种探针能够灵敏度高、特异性好、耗时短的检测核因子‑κB；所述探针为DNA双链探针；所述DNA双链探针由DNA‑1和DNA‑2反向互补形成；所述DNA‑1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述DNA‑2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明开发了一种简便、灵敏的核因子‑κB检测方法。该方法结合了DNA结合蛋白质、核酸外切酶III(Exo‑III)和等温指数扩增技术，采用分子信标依赖性扩增荧光分析技术成功地实现了信号的双重放大。与其他方法相比，该方法具有较高的特异性和较低的检测限，可直接用于癌细胞核提取液中核因子‑κB的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测核因子-κB的试剂盒及其应用。

背景技术

目前，严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)已席卷全球，对人类健康造成了严重的危害和影响。解剖结果显示新冠肺炎(COVID-19)患者的病理特征提示急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发生，而ARDS的病因是细胞因子风暴。当病毒侵入细胞后，核酸RNA的释放激活Toll样受体7(TLR7)并招募多个蛋白质形成复合物，进而促进转录因子(TFs)如干扰素调节因子7(IRF7)和核因子-κB(NF-κB)进入细胞核，然后激活促炎细胞因子的表达，导致免疫系统过度活跃，从而引起细胞因子风暴，这通常是危险和致命的。在这一过程中，转录因子起着极其重要的作用，因此转录因子的准确测定在生物学研究和临床诊断中具有重要意义。

转录因子包含一个或多个DNA结合域(DBDs)，它们与特定的DNA序列结合以调节基因转录。可以作为自然开关，将温度变化、光照、药物浓度和氧化还原状态等物理和化学信号转换为转录变化。因此，转录因子在基因表达调控的途径和网络中起着重要作用。转录因子信号失衡与癌症、发育障碍、炎症和自身免疫有关。其中NF-κB是一种重要的诱导性转录因子，几乎存在于所有细胞中。NF-κB二聚体可与基因组中的NF-κB位点结合，调节靶基因的表达，涉及免疫、炎症和癌症等许多重要的生物学过程。对于NF-κB，它已成为医学诊断和药物开发的潜在靶点。

由于转录因子的重要性，其检测技术越来越受到重视。目前检测转录因子的方法主要有电化学法、放射性凝胶迁移实验(EMSA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而，这些方法都存在一些不足。对于电化学方法，样品消耗量大，而复杂的电极修饰过程通常耗时费力。虽然放射性凝胶迁移实验简单而敏感，但放射性同位素的应用给研究人员和周围环境带来了安全隐患。酶联免疫吸附试验由于加入了抗转录因子的特异性抗体，应用范围过于狭窄。此外，在一些典型的荧光放大策略中，可以直接检测到溶液中的转录因子。转录因子的存在可以促进DNA双链的形成，产生强烈的荧光共振能量转移(FRET)。然而，蛋白质与DNA的结合可能产生空间位阻，导致荧光信号很低。因此，还需要开发新的转录因子检测方法。

分子信标(MB)是一种新型的颈环结构探针，是一种由环状区、干区、荧光基团和猝灭剂组成的荧光标记寡核苷酸链。由于其高灵敏度、无毒性和高特异性，分子信标被越来越广泛地用于检测和分析溶液中特定的核酸序列或蛋白质。当分子信标单独存在时，茎上的荧光基团和猝灭剂相互接近，荧光基团的荧光被猝灭。当目标核酸出现在溶液中时，会引起分子信标在杂交过程中的构象变化。荧光基团和猝灭剂彼此分离，从而恢复荧光。因此，荧光强度的变化可以确定溶液中是否有目标核酸。在蛋白质检测中，目标核酸可以通过靶蛋白与DNA探针和工具酶的反应释放出来。通过使用分子信标检测核酸来达到检测和分析目标蛋白的目的。而目前的一些基于分子信标检测蛋白质的信号放大策略都存在灵敏度低、耗时长、设计过于复杂等缺点。因此，有必要建立一种经济、灵敏、快速、特异性强的转录因子检测方法。

发明内容

因此，目前的一些基于分子信标检测蛋白质的信号放大策略都存在灵敏度低、耗时长、设计过于复杂等缺点。本发明提供一种灵敏度高、特异性好、耗时短的检测核因子-κB的探针及其相关的产品和应用。