[发明专利]稳定表达hFcRn细胞株的制备方法及其在药物筛选中的应用

说明书

本发明公开了一种FcRn稳定表达的细胞系及其在药物筛选中的应用，本发明提供了该细胞株的构建方法及其应用实例，包括(1)将FcRn基因插入真核表达载体；（2）将步骤1得到的载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到稳定表达FcRn的细胞系；3）步骤2得到的细胞系用于药物筛选。本发明的独特之处在于1）实现了FcRn和β2M蛋白的同比例共表达，便于组装有功能活性的FcRn异源二聚体；2）选用有极性特征的细胞比如MDCK细胞作为FcRn表达的宿主细胞，便于做FcRn介导的抗体或其它药物分子内吞、外泌及跨膜转运的能力测试；3）提供了应用相应的细胞株检测、筛选以FcRn为基础的药物内吞、外泌及跨膜转运的基本方法和技术途径。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达hFcRn细胞株的制备方法及其在药物筛选中的应用

背景技术

hFcRn是由大小两个亚基组成的异源二聚体，分别为分子量45～53kD的α链和分子量14kD的β2微球蛋白(β2microglobin orβ2M)。β2微球蛋白对于hFcRn的生物学功能至关重要。晶体结构显示hFcRn与抗体的结合区域是CH2～CH3,在生理PH＝7.4时，抗体与FcRn解离结合，在酸性条件PH＝6.0时hFcRn与抗体结合。FcRn在体内分布广泛，能够介导抗体或抗体类似物的内吞、外泌和跨膜转运，所以与FcRn的结合决定了IgG抗体在体内的半衰期。Shreeram Akilesh等使用FcRn缺陷型小鼠的研究结果表明，致病性 IgG在FcRn缺陷型小鼠血液中被快速清除，因此降低了致病性IgG在FcRn缺陷型小鼠中的致病性，提示通过抑制FcRn可以用于治疗由自身抗体引起的自身免疫疾病(Shreeram Akilesh等，2004，J ClinInvest. 113(9):1328-33)。同时，为了延长药物在体内的半衰期，也可以通过结合FcRn的方式，比如抗体或Fc融合蛋白，降低相关药物的血清清除率并延长药物的体内半衰期，并进而降低药物的注射频率。

在大鼠诱发性自体免疫重症肌无力模型中实验中表明，用FcRn重链特异性单克隆抗体治疗可以使血清中致病性IgG浓度降低，从而减轻疾病程度(Liu等，2007，J.Immunol.178：5390-5398)。在鼠关节炎模型中，高亲和力FcRn抗体可以使疾病得到改善(Patel等，2011，J.Immunol.187：1015-1022)。在许多自体免疫性疾病中，高剂量施用IgG也可以缓解病情(Jin和Balthasar，2005，Hum.Immunol.66：403-410；Akilesh等， 2004，J.Clin.Invest.113：1328-1333；Li等，2005，J.Clin.Invest.115：3440-3450)。以上这些结果综合说明抑制FcRn能够缩短致病性IgG的体内半衰期，从而达到治疗自身免疫疾病的目的。

在筛选、评估FcRn抑制剂或结合蛋白(包括短肽、基因工程改造的蛋白或抗体)的过程中，需要一种能够有效模拟FcRn介导的内吞、外泌和跨膜转运等过程的体外细胞模型。本发明建立了MDCK-hFcRn细胞模型，其独特之处在于实现了人源FcRn和人源β2M蛋白的同比例共表达，便于组装有功能活性的人源FcRn 异源二聚体；选用有极性特征的细胞比如MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞作为hFcRn表达的宿主细胞，便于做hFcRn介导的抗体或其它药物分子内吞、外泌及跨膜转运的能力测试。

发明内容

本发明提供一种稳定表达hFcRn细胞株的制备方法及其应用。

本发明提供的稳定表达hFcRn细胞株的制备方法，具体步骤如下：

将人源FcRn和人源β2M基因克隆到真核表达载体。

该真核表达载体具有如下特点：