[发明专利]一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明采用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)ATCC1381为原始菌株，通过基因工程手段在大肠杆菌中构建过表达载体，选择博莱霉素作为筛选抗性基因，真核生物的高保守序列18S rRNA作为同源臂，将线性化的过表达片段电转进入裂殖壶菌内，得到一株高产角鲨烯的基因工程菌株，为微生物生产角鲨烯以及产品工业化奠定了理论基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

角鲨烯是由6个异戊二烯单位构成的脂质不皂化物，因其具有防御病毒、延缓衰老、抗击肿瘤等多种功效而被广泛用于食品、医疗、美容等领域。角鲨烯目前市场的主要来源是鲨鱼肝油，植物油中含量也较为丰富。随着角鲨烯的市场需求逐日上升，自然资源限制和化学合成方法复杂的反应以及极低的产率使角鲨烯满足不了需求，所以利用微生物资源生产角鲨烯的方式已经成为未来的发展趋势。这种方式凭借着周期短、操作简单、生产潜力大等优势引起了人们极大的关注。破囊壶菌、微藻、酵母以及类酵母是近年来研究的热点。有报道显示，从海水中筛选出来的破囊壶菌18W-13a角鲨烯产量可以达到1.29±0.13g/L；优化后的酿酒酵母角鲨烯产量达到11.00g/L，是目前已知基因工程菌株的最高产量。

基因工程是改造菌株的重要方式，通过基因工程手段提高角鲨烯的产量是目前研究的重心。有报道显示，通过基因改造将真菌甲羟戊酸途径相关的基因导入大肠杆菌中表达，角鲨烯产量达到52.1mg/L，实现了大肠杆菌基因工程菌株产角鲨烯的重大突破；另外，在酿酒酵母中过表达酰基转移酶的基因提高了油脂含量，为角鲨烯提供了更多的储存空间。

裂殖壶菌属于破囊壶菌属，是一类海洋真菌，因其可以高产不饱和脂肪酸而广为人知。裂殖壶菌生长速度快，发酵周期短，耐机械搅拌，是一种食品安全菌。角鲨烯是裂殖壶菌甲羟戊酸途径中合成甾醇类化合物的中间产物，在法尼转移酶或角鲨烯合酶催化下，两个法尼焦磷酸头头缩合并被NADPH还原为含有30个碳的碳氢化合物——角鲨烯。裂殖壶菌油脂含量占细胞干重的50％以上，为角鲨烯提供了良好的储存场所。截止目前还未有通过基因工程技术对裂殖壶菌进行改造以生产角鲨烯的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明以Schizochytrium sp.ATCC1381为受体菌株，通过过表达鲨烯合成酶基因(SQS)以提高重组菌中角鲨烯的产量，这对未来裂殖壶菌的基础理论研究和产品开发具有重要的意义。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，所述菌株是选用产油Schizochytrium sp.ATCC1381为材料构建而成，所述菌株含有来源于Schizochytriumsp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS。

所述菌株中的角鲨烯合成酶基因(SQS)克隆于原始Schizochytriumsp.ATCC1381，该菌株对所述的角鲨烯合成酶基因(SQS)过表达，增加了基因拷贝数，提高了角鲨烯产量。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种过表达角鲨烯合成酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，包括：

1)克隆来源于Schizochytrium sp.ATCC1381的角鲨烯合成酶基因SQS，并通过基因同源重组技术将该基因插入pBluzeo-18S质粒中，构建过表达载体pBluzeo-SQS-18S；

2)用线性化后的所述过表达载体pBluzeo-SQS-18S电转导入Schizochytriumsp.ATCC1381，获得过表达角鲨烯合成酶基因SQS的裂殖壶菌基因工程菌株。