[发明专利]一种烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆和应用

说明书

本发明公开了烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6及其克隆方法与应用，烟碱合成负向调控基因NtARF6核苷酸序列如SEQ ID：NO:1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：NO:2所示。本发明还公开了烟碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtARF6基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtARF6基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、构建了含NtARF6基因的过表达载体。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，制备转基因植株。获得的转基因植株尼古丁含量平均下降36.2％；降烟碱含量平均下降50.5％；假木贼碱含量平均下降44.9％；新烟碱含量平均下降60.2％。说明烟草NtARF6基因在培育低烟草生物碱含量的烟草品种方面具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法与应用。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum)是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95％左右。

ARF(Auxin Response Factor)类型的转录因子基因是普通烟草生长发育过程当中重要的调控因子。烟草中调控尼古丁生物合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个乙烯响应因子ERF基因组成，如NtERF189，NtERF179等。近年来，随着基因组和测序技术的发展，正向调控烟草尼古丁生物合成调控因子已经基本明确，而且相关分子调控机理也逐渐清晰。相比之下，烟草中能够负向调控尼古丁生物合成的调控因子却鲜见报道。具相关文献报道，负向调控烟草尼古丁合成基本上是通过直接或间接影响不同植物激素之间的互作来实现的，比如生长素(IAA)、乙烯利(Ethylene)。我们通过对乙烯利处理后烟草根部组织转录组进行分析后获得NtARF6基因表达模式和NtARF6与相关尼古丁合成代谢酶转录组共表达分析的结果，确定了NtARF6与尼古丁合成直接相关，相关应用实践结果表明过表达NtARF6能够显著降低烟草烟叶中四种生物碱的含量，此结果为利用植物基因工程技术降低烟叶中生物碱含量提供了靶标基因。

国际上一些知名烟草公司和相关烟草研究机构正在开展利用生物技术手段降低烟草尼古丁含量进行研究，用来积极应对新型烟草制品原料的商业需求，从而提高烟草品质，也为降低电子烟等产品的尼古丁原料生产成本。目前，我国也深入研究研究合成调控机理，为培育低尼古丁烟草品种提供理论基础。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6；第二目的在于提供所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、确定NtARF6基因序列；

通过分析乙烯利处理烟草根部组织的转录组数据，获得受乙烯利正向调控ARF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtARF6。根据该基因序列设计基因克隆引物：

正向引物NtARF6-BamH I：GGATCCATGAGGGTATCTTCAGCTGGGTTCA；

反向引物NtARF6-Xho I：CTCGAGTTACTGCCAGGGATCGTCACCGAGG；

B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；