[发明专利]一种烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆和应用

权利要求书

1.一种烟草烟碱合成负向调控基因NtARF6，其特征在于所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草生物碱负向合成调控基因NtARF6，其特征在于所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求1所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

A、确定NtARF6基因序列；

根据乙烯利处理烟草根部组织转录组分析获得NtARF6基因序列。利用此序列设计基因克隆引物：

正向引物NtARF6-BamH I：GGATCCATGAGGGTATCTTCAGCTGGGTTCA；

反向引物NtARF6-Xho I：CTCGAGTTACTGCCAGGGATCGTCACCGAGG；

B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtARF6基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；

D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL -BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

4.根据权利要求3所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。

5.根据权利要求3所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应条件是在pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。

6.一种权利要求1或2所述的负向调控烟草叶片生物碱含量的基因NtARF6的过表达载体，其特征在于所述的负向调控烟草叶片生物碱含量的基因NtARF6的过表达载体为pK2GW7-NtARF6。

7.一种权利要求1所述的烟草生物合成负向调控基因NtARF6的应用，其特征在于所述的烟草生物合成负向调控基因NtARF6在用于获得烟草生物碱含量显著降低的转基因植株中的应用。