[发明专利]一种单链DNA肽连接酶sDPlaseI及其使用方法

说明书

本发明提供了一种新型的可用于催化特定单链DNA和特定多肽共价连接的单链DNA肽连接酶sDPlaseI及其酶学特性和使用方法。sDPlaseI酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：3所示；sDPlaseI酶可以识别5’末端起始为5’‑ATGATCCAG‑3’序列且其5’末端脱氧核糖核苷酸A为磷酸化状态的特定DNA单链和C末端起始为N’‑MANCEHL‑C’这7肽的特定多肽链，并催化这两者以共价键相互连接在一起；单链DNA和多肽连接产物在358nm波长处有特征吸收峰，可用于sDPlaseI连接酶反应活性的测定。sDPlaseI连接酶缓冲液是由pH为7.5的500mM Tris‑Hcl、100mM Mg²⁺、10mM ATP和10mM DTT组成，其最适反应的温度范围是30℃‑40℃，连接反应时间为5min‑15min。本发明提供的全新的单链DNA多肽连接酶，可以作为基因工程和基因分析的工具酶。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种全新的可以连接特定单链DNA和特定多肽的连接酶及其使用方法。

背景技术

基因工程领域离不开各种分子生物学工具酶，这些工具酶可以实现体外的核酸扩增、转录或反转录、消化或切除、连接和修饰以及蛋白的消化或切除等，被广泛用于目的基因扩增、核酸序列分析、重组体DNA制备、载体构建、核酸探针标记和蛋白分析等领域，例如DNA聚合酶是PCR体系中的核心组分，cDNA文库的构建离不开RNA聚合酶。基因工程常用的工具酶，主要是DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶，此外还有RNA聚合酶、反转录酶、核酸外切酶、DNA甲基化酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、多核苷酸激酶、碱性磷酸酯酶、末端核苷酸转移酶以及各种蛋白酶等。目前商品化的分子工具酶大多数来源于微生物，主要是由于微生物生长增殖速度快、新陈代谢旺盛，此外也便于这些酶的表达和分离纯化。自然界中的微生物种类繁多，其所处的微生态各种各样，因此其新陈代谢形式和过程多种多样，这些都离不开相应的能执行各种生化反应的酶，因此微生物是分子酶的巨大资源库。例如来源于T4噬菌体的T4连接酶，该酶原本就是噬菌体用于修复被宿主细胞的限制性核酸内切酶切断的DNA的，其连接效率十分高效。随着越来越多的酶分子被挖掘，分子工具酶的数量和用途不断增加，这大大开拓了基因工程的研究和应用领域。

申请人前期在研究干枯稻草降解的微生物生态体系时，发现体系中存在着一种特定的单链RNA肽连接酶，可以识别特定mRNA的5’端特定序列并将其和特定多肽进行共价连接，从而调控特定mRNA翻译为蛋白这一过程。进一步的借助生物信息分析设计，申请人对该单链RNA肽连接酶基因进行改造，开发出了1种特定的单链DNA肽连接酶和2种特定的双链DNA肽连接酶，分别可以识别特定单链DNA的5’末端上特定DNA单链序列或特定双链DNA的5’末端上特定DNA双链序列并将其和特定多肽进行共价连接。在对这些核酸肽连接酶外源表达的基础上，申请人探究了其酶学特性和使用方法。目前已有多种商业化的DNA连接酶（如美国赛默飞公司的T4 DNAlagase）和修饰酶（NEB公司的DNA甲基化酶），仅是对核酸片段进行相互连接和特定修饰，尚未见报道可以实现核酸片段和多肽片段相互共价连接的连接酶。本发明提供了全新的核酸多肽连接酶，可以作为基因工程和基因分析的工具酶，在核酸标记和核酸分析等领域中具有巨大的应用前景。

发明内容

本发明提供了新的可用于连接特定核酸片段和特定多肽片段的核酸多肽连接酶及其酶学特性和使用方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：