[发明专利]一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法

说明书

本发明公开了一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，包括使用无血清悬浮细胞培养法或者顺铂细胞培养法富集人卵巢癌A2780细胞初步筛选出肿瘤干细胞，再根据卵巢癌干细胞的标志物ALDH1,使用流式细胞仪进一步分选。本发明结合了现有悬浮培养法及流式分选方法、药物筛选富集法及流式分选方法的优点，通过无血清悬浮培养或者化疗药物筛选，使卵巢癌中的肿瘤干细胞富集，再通过流式细胞仪分选，从而保证卵巢癌肿瘤干细胞分选的效率。本发明卵巢癌干细胞得率可达54.8％，为下一步研究卵巢癌干细胞的提供条件。

技术领域

本发明涉及肿瘤干细胞分离技术，尤其涉及卵巢癌干细胞分离技术。

背景技术

肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤中具有高度的增殖、自我更新和分化潜能的一类细胞，同时具备干细胞和肿瘤细胞的特征，它们被认为是肿瘤演进、转移复发的“种子”，大量的临床和实验观察证实它们与肿瘤放化疗耐受以及肿瘤患者预后较差密切相关。很多研究已证实多种实体肿瘤中含有CSCs。然而，越来越清楚的是，CSCs不一定是罕见和/或静止的。肿瘤干细胞的发现和理论深入离不开对肿瘤标志物的研究。不同肿瘤组织所含的CSCs标志物不尽相同，目前体外实验已证实卵巢癌中高表达ALDH1、CD133、CD44等分子的这一类细胞具有致瘤性和促进肿瘤转移的能力。

CSCs在肿瘤组织和细胞中只占很少的比例，一般不到1％，因此CSCs的分离有难度。常见分离CSCs的常用技术有以下两大类：第一，利用CSCs表面标志物进行分离(以CSCs标志物、生物酶类及特定染料等为基础的流式细胞术；免疫磁珠技术)；第二，利用CSCs的生物学特性进行分离(无血清悬浮成球培养；根据CSCs的耐药特性,采用Hoechst33342染色分选侧群(side population,SP)细胞；CSCs异体成瘤富集)。其中最为常用及可靠的方法就是利用CSCs表面标志物来进行筛选分离。研究发现，CSCs与一般的干细胞具有一些相似性(自我更新和多向分化)，最初用于分析成体干细胞的方法被用来研究CSCs。体内成瘤实验是目前能用于CSCs鉴定的金标准。该方法包括评估CSCs在免疫缺陷小鼠中的成瘤能力。最初是用来检测白血病。随后，其应用被拓展到实体瘤，包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌和头颈癌。然而，体内成瘤实验不仅昂贵，而且耗时，平均需要6个月，甚至更长时间。因此，需要一个有效而且廉价的体外实验模型。肿瘤成球实验被普遍用于各种CSCs相关的研究，常常作为体内成球实验的替代方法。

近些年，随着在不同肿瘤中更多CSCs相关标志物的发现，该方法不仅用于CSCs的分离鉴定，临床诊断和基础研究中，也在开发抗CSCs靶向治疗的方法中，均具有非常好的前景。CSCs理论可能是目前生物医学研究最具争议的话题之一，近10年，出现了肿瘤干细胞、干细胞样肿瘤细胞、肿瘤启动细胞及肿瘤增殖细胞等多种命名方式。关于CSCs理论的争议，主要集中在CSCs的来源，以及其表型和功能特征。最近一些CSCs相关的临床试验，取得了振奋人心的结果，初步证明针对CSCs治疗方式的可行性。随着对CSCs生物学了解的深入，功能分析模型的改善及在生物技术上的进步(基因表达谱分析、二代测序和高通量筛选)，靶向CSCs治疗为复发性及对传统治疗方法耐受的肿瘤提供了非常有潜力的治疗手段。CSCs驱使肿瘤的侵袭和复发，因此鉴别和纯化CSCs是CSCs研究中的关键。

尽管分析细胞表面标志物是一种非常方便鉴别方法，但其可靠性依赖于所选择的标志物是否稳定、普遍和特异，在CSCs鉴别中受肿瘤表型和基因的异质性的影响。因此，在过去的10年间，研究者尽管发现了通过肿瘤不同的表面标志物的组合能成功检测和分离不同类型的CSCs，但在临床上将该方法标准化还是一个极大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法。