[发明专利]改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用。其中，该制备方法包括以下步骤：将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，然后加入待固定的酶和戊二醛进行固定得到改性环氧树脂固定化酶。应用本发明的技术方案，将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，并通过树脂中的醛基与聚乙烯亚胺中的氨基共价结合每种酶，然后通过双功能试剂戊二醛活化，通过这种方式，空间树脂臂增加，形成网状结构，通过共价结合可以更容易地结合酶，因为空间抑制减少，酶负荷也可以得到改善。

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，具体而言，涉及一种改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用。

背景技术

酶作为生物催化剂广泛用于不同的工业过程，与化学催化剂相比酶具有高活性、选择性强和特异性高的优点。酶能够在非常温和的反应条件下生成复杂的化合物，这就使得人们能够开发出更具可持续性的工艺，从而使得酶催化工艺成为新兴的平台。由于酶是生物来源的，所以它们通常具有与工业过程所需的操作特性不同的操作特征。

生物催化剂可以使用全活细胞、死细胞、粗酶或纯化酶来生产，这取决于酶的类型和应用。酶的可扩大生产和蛋白质工程的进步使得生物催化剂有可能实现商业化应用，并且具有较好的经济价值。

由于酶具有独特的工艺和成本优势，其被越来越多地应用于工业过程中，这也对酶的固定化形式提出了越来越高的要求。通常称为“生物催化剂”的固定化酶广泛用于工业有机合成和生物转化。

在生物技术过程中成功使用酶的最有用的策略之一是它们的固定化。适当的酶固定是提高酶性能的有力工具，例如对剧烈反应条件的抵抗(例如，远离其生理范围的pH和温度)，增强的酶活性、循环使用性能、连续使用性能，以及改善的底物特异性、对映体特异性或产物选择性。

新型固定化平台的出现使得固定化酶在连续流动生物催化中完美整合。新型高效酶的发现和进化、强调生物催化的新型反向合成方法、降低的重组蛋白成本和酶固定化策略等都是生物催化在连续合成中应用的良好基础。

基于酶的氨基酸侧链的官能团独特特征可以通过以下几种方式使其与载体进行固定：可逆键(如范德华力、疏水或离子键)和不可逆化学键(如共价连接)吸附在载体表面上(Sheldon等2013)。

共价连接使生物催化剂与载体不可逆结合，因此，可以防止酶泄漏并有效地提高酶的可回收性。在共价载体中，环氧活化载体几乎是理想的基质，可以在实验室和工业规模上非常容易地固定蛋白质(Hannibal-Friedrich et al 1980；Hernaiz et al 2000；Calleri et al 2004；Podgornik,H.et al 2002)。这些载体以激活形式存在。此外，这些载体即便悬浮在中性水性介质中在储存和运输过程中也非常稳定，其可以用于长期固定，允许酶完全覆盖支持表面。在非常温和的实验条件(例如pH 7.0)下环氧活化载体与蛋白质反应，可以促进蛋白质(仲胺，硫醚和醚)的非常小的化学修饰。

通常，可溶性蛋白质在中性pH值下几乎不与环氧基团反应。环氧树脂载体的这种低反应性导致酶在这些载体上的固定通过两步机制产生：首先，蛋白质快速温和的物理吸附在载体上；其次，吸附蛋白与邻近环氧基团之间发生共价反应[Wheatley et al 1999；Bauer-Arnaz et al 1998]。

由于这种机制，用于固定蛋白质的商业环氧树脂载体是相当疏水的，以便当它们以高离子强度(通过疏水相互作用)温育时吸附蛋白质。在一些情况下，使用疏水性载体可以促进蛋白质结构的错误折叠，该蛋白质结构由位于外层的内部疏水性氨基酸的异常结构的稳定化引起(Fitzpatrick PA et al 1993)。此外，通常使用高浓度盐可以使不同酶的活性丧失，尤其是亚基之间的通过离子力连接的多聚体酶的活性(Fernandez-Lafuente etal 2009)。尽管环氧树脂载体是非常重要的固定平台，但随着新酶的出现，特别是进化的多聚酶，需要在环氧树脂载体上进行整体改进和新的固定化过程。