[发明专利]甜菊糖苷莱苞迪苷J和莱苞迪苷N的生物合成生产在审
申请号: | 201980018867.0 | 申请日: | 2019-03-12 |
公开(公告)号: | CN111868252A | 公开(公告)日: | 2020-10-30 |
发明(设计)人: | 毛国红;M·巴腾;P·宏特;余晓丹 | 申请(专利权)人: | 科纳根公司 |
主分类号: | C12P19/56 | 分类号: | C12P19/56;C12P19/44;C12N9/10;A23L27/30;C07H15/24;C07H15/256;C07H1/00 |
代理公司: | 中国专利代理(香港)有限公司 72001 | 代理人: | 初明明;黄希贵 |
地址: | 美国马*** | 国省代码: | 暂无信息 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 甜菊糖 苷莱苞迪苷 莱苞迪苷 生物 合成 生产 | ||
本公开涉及通过使用莱苞迪苷A作为底物和涉及各种1,2RhaT‑鼠李糖基转移酶的生物合成途径来产生甜菊糖苷莱苞迪苷J和莱苞迪苷N。
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月12日提交的美国临时专利申请号62/641,590和2018年6月8日提交的美国临时专利申请号62/682,260的优先权,这两个临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开一般涉及甜菊糖苷的生物合成。更具体地,本公开涉及用于制备包含莱苞迪苷J(“Reb J”)和/或莱苞迪苷N(“Reb N”)的组合物的生物催化方法,以及具有在用于产生Reb J和/或Reb N的相关生物合成途径中有用的酶活性的重组多肽。
背景技术
甜菊糖苷是在甜叶菊(Stevia rebaudiana)植物的叶中发现的一类化合物,其可用作高强度、低热量的甜味剂。这些天然存在的甜菊糖苷共有相同的基本二萜结构(甜菊醇主链),但在甜菊醇主链的C13和C19位置的糖残基(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的数量和类型方面不同。有趣的是,基本甜菊醇结构的糖“装饰”中的这些变化通常显著且不可预测性地影响所得甜菊糖苷的特性。受影响的特性可包括但不限于总体口感特征、任何异味的存在和程度、结晶点、“口感”、溶解度和感觉到的甜度以及其他差异。具有已知结构的甜菊糖苷包括甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、莱苞迪苷M、莱苞迪苷J、莱苞迪苷N和杜尔可苷A。
基于干重计,甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷C和杜尔可苷A分别占野生型甜叶菊叶中发现的所有甜菊糖苷的总重量的约9.1%、3.8%、0.6%和0.3%。其他甜菊糖苷诸如RebJ和Reb N以显著更低的含量存在。来自甜叶菊植物的提取物是可商购获得的。在此类提取物中,甜菊苷和莱苞迪苷A通常是主要组分,而其他已知的甜菊糖苷则作为微量或痕量组分存在。在任何给定的甜叶菊提取物中的各种甜菊糖苷的实际含量水平可根据例如甜叶菊植物生长的气候和土壤、收获甜叶菊叶的条件和用于提取期望的甜菊糖苷的方法而变化。出于说明,商业制备物中莱苞迪苷A的量可在总甜菊糖苷含量的约20重量%至大于约90重量%之间变化,而莱苞迪苷B、莱苞迪苷C和莱苞迪苷D的量可分别为总甜菊糖苷含量的约1重量%至2重量%、约7重量%至15重量%和约2重量%。在此类提取物中,莱苞迪苷J和莱苞迪苷N各自通常占总甜菊糖苷含量的小于0.5重量%。
作为天然甜味剂,不同的甜菊糖苷具有不同程度的甜味、口感和余味。甜菊糖苷的甜度显著高于食用糖(即蔗糖)的甜度。例如,甜菊苷本身的甜度是蔗糖的100-150倍,但具有苦的回味,如在许多味道测试中所注意到的,而莱苞迪苷A和E的甜度是蔗糖的250-450倍,并且回味特征比甜菊苷好得多。然而,这些甜菊糖苷本身仍保持明显的余味。因此,任何甜叶菊提取物的总体味道特征均受提取物中各种甜菊糖苷的相对含量的深刻影响,而所述相对含量又可受植物来源、环境因素(诸如土壤含量和气候)和提取方法的影响。特别地,提取条件的变化可导致甜叶菊提取物中甜菊糖苷的组成不一致,使得味道特征在不同批次的提取产品中变化。甜叶菊提取物的味道特征也可能受提取过程后保留在产品中的植物来源或环境来源的污染物(诸如色素、脂质、蛋白质、酚类和糖类)的影响。这些污染物通常具有对于将甜叶菊提取物用作甜味剂来说不期望的异味。此外,分离在甜叶菊提取物中不丰富的单独或特定组合的甜菊糖苷的方法可能会在成本和资源上令人望而却步。
此外,从植物中提取的方法通常采用使用溶剂诸如己烷、氯仿和乙醇的固-液提取技术。溶剂萃取为能量密集型方法,并且可能导致与有毒废物处理有关的问题。因此,需要新的生产方法来降低甜菊糖苷的生产成本以及减轻大规模培养和加工的环境影响。
因此,在本领域中需要一种新的制备甜菊糖苷特别是微量甜菊糖苷诸如Reb J和Reb N的方法,其可产生具有更好和更一致的味道特征的产品。更优选地,此类制备方法可利用更丰富的甜菊糖苷诸如Reb A以降低生产成本。
发明内容
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- 本发明公开了一种葡萄糖基甜菊糖苷的生产方法,属于天然食品添加剂技术领域。所述方法包括以下步骤:(1)CGT酶转化:环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)作为GSG的转糖苷反应工具,以可溶性淀粉、麦芽糊精、直链淀粉或支链淀粉作为糖基供体,以任意一种甜菊糖苷单体(如RA、ST、RD或RM等)或其混合物,也可以是工业甜菊糖生产所产生的母液糖及其纯化产物作为受体生产糖基数较高的GSG;(2)α葡萄糖苷酶酶切:在步骤(1)获得的GSG中加入α葡萄糖苷酶,通过控制反应的时间等条件,有选择性目的性地调控葡萄糖基甜菊糖苷的糖链长度。最终以较为简单的两步酶反应工艺生产富含4‑7个葡萄糖基的味觉品质较高的GSG产品。
- 一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法-201910095404.6
- 李艳;陈量量;贾红华;潘华祎;欧阳平凯 - 南京工业大学
- 2019-01-31 - 2022-04-19 - C12P19/56
- 本发明公开了一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法,该方法利用番茄来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶,以甜菊甙为原料一步糖基化反应生产莱鲍迪苷E,同时采用定点突变技术,改造UDP‑糖基转移酶,进一步提高莱鲍迪苷E的产率。本发明的方法无需添加UDP‑葡萄糖和UDP,利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖在蔗糖合成酶分解作用下获得UDP‑葡萄糖作为糖基化反应的原材料,建立双酶循环反应体系,有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E。其中,莱鲍迪苷E产率可达65%以上;后期通过定点突变技术,经筛选获得N358F有益突变体,其催化莱鲍迪苷E产率提高,最高可达85%以上。与已有的莱鲍迪苷E制备方法相比,工艺步骤简单,成本低廉,且产率高,具有重要的应用价值。
- 一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法-202111393395.2
- 杨乐;张敏;祁飞;戴永辉 - 安徽金禾实业股份有限公司
- 2021-11-23 - 2022-03-22 - C12P19/56
- 本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法,其特征在于:(1)将糖基转移酶UGT76G1和UGT11基因连到PBR322质粒载体上,导到枯草芽孢杆菌中,接入LB培养基,30~37℃、100‑250 rpm下培养20~24 h;(2)按1%~10%接种量接到种子罐,200~400 rpm、通气比0.1~1 V/V.min、30~37℃下培养20~24 h;(3)按1%~10%接入发酵罐,200~1000 rpm、通气比0.1~2 V/V.min、30~37℃、pH6~8下培养48~72h;(4)陶瓷膜超滤发酵液,菌体重悬、高压均质、陶瓷膜超滤菌体破碎液,得粗酶液;(5)将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5‑10:1‑5:40‑60:5‑20混合,25‑40℃反应12‑48 h。本发明优点:一次发酵获得两种粗酶液,操作简单,成本低,转化率在88.4%以上。
- 一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷D的方法-202111392894.X
- 杨乐;祁飞;张敏;戴永辉 - 安徽金禾实业股份有限公司
- 2021-11-23 - 2022-03-08 - C12P19/56
- 本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷D的方法,其特征在于:(1)将糖基转移酶UGT76G1、AtSUSY基因接到PBR322质粒载体上,导到枯草芽孢杆菌中,再接入LB培养基,30~37℃、100‑250 rpm下培养20~24h;(2)按1%~10%的接种量接到种子罐,200~400 rpm、通气比0.1~1 V/V.min、30~37℃下培养20~24 h;(3)按1%~10%体积比接入发酵罐,200~1000 rpm、通气比0.1~2 V/V.min、30~37℃、pH为6~8下培养48~72h;(4)采用陶瓷膜超滤发酵液,菌体重悬、高压均质破碎,陶瓷膜超滤破碎液,得粗酶液;(5)将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、Tris‑HCl缓冲液、粗酶液按质量比5‑10:1‑5:40‑60:5‑20混合,25‑40℃下反应12‑48 h。本发明优点:一次发酵得两种粗酶液,成本低,莱鲍迪苷D转化率达到88‑90 g/L。
- 人参糖基转移酶在合成甜菊糖中的应用-202111102846.2
- 林影;陈美琪;梁书利;韩双艳;郑穗平 - 华南理工大学
- 2021-09-16 - 2021-12-31 - C12P19/56
- 本发明公开了人参糖基转移酶在合成甜菊糖中的应用,所述糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述人参来源的糖基转移酶PgUGT具有催化合成莱鲍迪苷E与莱鲍迪苷D的新功能,通过酶法可催化合成获得大量的莱鲍迪苷E与莱鲍迪苷D,产率达到97.2%以上,转化率高,进一步降低成本,操作简便,适合大规模推广和工业化实施。而且本发明利用基因工程获得可以高产表达人参来源糖基转移酶,得到适合产业化的廉价易得的高活性生物酶。
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