[发明专利]一种中药提取环肽改性的金属表面的制备及防污评价方法

权利要求书

1.一种中药提取环肽改性的金属表面的制备方法，包括以下步骤：

（1）将紫花地丁晾干、碾碎成粉末；

（2）使用10L乙醇和水的混合溶液提取1000 g紫花地丁粉末中的抗菌环肽，并以微波辅助；

（3）通过高速离心将含有紫花地丁的溶解液实现固液分离，以获得含有抗菌环肽的溶液；

（4）使用高效液相色谱仪分离、纯化抗菌环肽；

（5）使用0.1µM 三(2-羧乙基)膦和0.5 µg/µL的胰蛋白酶还原和消化环肽；

（6）选取304不锈钢为基底，将其抛磨至镜面，清洗、干燥后使用2 mg/mL的多巴胺溶液浸泡24h，从而得到表面活化的不锈钢；

（7）将活化的不锈钢表面浸入抗菌环肽的溶液中24 h，取出样本，在氮气环境下晾干；

（8）分别使用XPS、接触角测量仪、表面轮廓仪表征样本表面的化学成分、亲疏水性和表面形貌，分析采集的数据得到样本表面的粗糙度、表面能和稳定性；

（9）选用需钠弧菌、法式柠檬酸杆菌、芽孢杆菌、海藻三角褐指藻、小球藻和舟形藻，分别扩大培养细菌和海藻至对数期，将抗菌环肽修饰的金属表面浸泡在稀释后的菌液中，每隔12 h观察细菌粘附情况，将抗菌环肽修饰的金属表面浸泡在稀释后的海藻溶液中，每隔24 h观察海藻粘附情况，海藻的附着实验需要12 h黑暗、12 h光照交替的条件；

（10）使用戊二醛固定溶液浸泡实验后样本，将细菌溶液浸泡的样本使用PI染色，海藻溶液浸泡的样本放入-4℃冰箱内待用，使用激光共聚焦荧光显微镜采集附着荧光图，观察样本表面细菌/海藻粘附率的变化，利用Image J计算吸附量。

2.根据权利要求1所述的一种中药提取环肽改性的金属表面的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，使用体积比为0.1％三氟乙酸（TFA）的水溶液为洗脱液的A液，含有体积比0.1％ TFA的80％乙腈水溶液为洗脱液的B液。

3.根据权利要求1所述的一种中药提取环肽改性的金属表面的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，还原和消化环肽后，使用液相质谱仪和元二色光谱仪分别获得抗菌环肽的氨基酸序列及空间结构。

4.根据权利要求1～3任一项所述的一种中药提取环肽改性的金属表面的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，乙醇和水的体积比为3:2。

5.使用1～4任一项所述的制备好的环肽改性的金属表面进行防污评价的方法，其特征在于，

（1）选用海洋优势菌株需钠弧菌、法式柠檬酸杆菌和芽孢杆菌，优势海藻三角褐指藻、小球藻和舟形藻，将细菌和海藻分别培养；

（2）将制备出的样本分别浸入细菌和海藻培养液中，一段时间后取出样本，清洗后使用戊二醛固定，一段时间后取出样本，清洗细菌溶液浸泡后的样本，使用碘化丙啶染色30min，然后洗掉残留的溶液，过程需注意避光；将海藻溶液浸泡后的样本使用戊二醛固定，利用激光共聚焦荧光显微镜观察样本表面细菌/海藻粘附变化，计算和分析样本表面的细菌/海藻粘附率变化，分析抗菌环肽修饰表面的抗菌/海藻机理，为获得具有抗菌/海藻的绿色防污表面提供方法和理论依据。