[发明专利]一种密码子优化的FAD-葡萄糖脱氢酶基因及其应用

说明书

本发明提供了一种密码子优化的FAD‑葡萄糖脱氢酶基因，所述基因来源于Aspergillus niger An76，其序列如SEQ ID No.2所示。该原始的FAD‑葡萄糖脱氢酶基因在毕赤酵母中无法成功表达，经过序列优化，其能够在毕赤酵母中顺利表达，并且，经过分离、纯化，能够得到纯化的目的蛋白，该重组FAD‑葡萄糖脱氢酶可以用于葡萄糖生物传感器中。

技术领域

本发明涉及生物酶基因工程和生物传感技术领域，具体涉及一种密码子优化的FAD-葡萄糖脱氢酶基因及其在制备生物传感元件中的应用。

背景技术

葡萄糖的准确、快速监测在医药、食品等行业有着重要意义，为此，生物传感器因其高特异性、分析时间短、可进行原位监测以及制造成本低等特点而成为葡萄糖监测的理想方法。虽然有这些优点，但是生物传感器仍然需要克服由用于检测的酶分子传感元件引起的问题。

在以酶为传感元件的生物传感器中，氧化还原酶是主要的生物识别元件，其中，葡萄糖氧化酶(GOX)是最常用的酶，GOX可以在氧气存在的条件下选择性的氧化葡萄糖成葡萄糖内酯，同时产生H₂O₂。然而，这类酶生物传感器的响应易受测量介质中氧浓度的影响，而使用人工电子介质会由于O₂的存在导致葡萄糖检测信号的降低从而低估葡萄糖含量。此外，如果是基于测定H₂O₂水平反映葡萄糖含量，常常需要很高的工作电势(与标准电极相比，通常超过+600mv)对H₂O₂进行氧化，因此存在于生物性液体中的很多其他电活性化合物也可能被氧化而引起假电流响应。而基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的生物传感器可以避免H₂O₂的产生，有望解决依赖H₂O₂检测葡萄糖的问题，但是这类酶必需向反应体系中额外添加昂贵的辅酶NAD⁺限制了这类酶的应用。因此，以吡咯喹啉醌(PQQ)或黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)成为构建不以O₂为电子受体或NAD⁺作为辅酶的生物传感器的合适候选酶类，但是部分GDH-PQQ分离自胞质外膜需要合适的洗涤剂溶解，而另外一部分水溶性GDH-PQQ特异性很低，这大大限制了这种酶类在生物传感器中的应用。GDH-FAD(FAD-葡萄糖脱氢酶基因)因其高催化效率、强底物专一性、低氧化还原电势以及不以O₂作为电子受体的特点，使其成为构建不依赖O₂的葡萄糖传感器最有应用潜力的酶分子元件。

真菌来源的GDH-FAD(EC 1.1.99.10)于1937年首次发现于米曲霉中，之后在土曲霉、黑曲霉、黄曲霉中也鉴定到GDH-FAD的存在。但是目前大部分GDH-FAD主要分离纯化自野生菌株，不容易进行重组表达，这也导致以GDH-FAD作为酶电极生物传感元件的研究较少，尤其是国内，只有少量关于GDH-FAD重组表达的研究，因此GDH-FAD高效重组表达及其在传感器领域的应用研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种密码子优化的FAD-葡萄糖脱氢酶基因。

本发明提供的密码子优化的FAD-葡萄糖脱氢酶基因来源于Aspergillus nigerAn76，其原始的基因序列如SEQ ID No.1所示，经过序列优化的基因序列如SEQ ID No.2所示。该原始的FAD-葡萄糖脱氢酶基因在毕赤酵母中无法成功表达，经过序列优化，其能够在毕赤酵母中顺利表达，并且，经过分离、纯化，能够得到纯化的目的蛋白。

另一方面，本发明还提供了包含FAD-葡萄糖脱氢酶基因的重组载体。本发明所述的载体包括克隆载体以及表达载体。

在一个实施方案中，所述克隆载体包括pUC系列的载体，例如，pUC18、pUC19；所述表达载体包括在大肠杆菌中表达的载体以及在毕赤酵母中表达的载体，优选的，包括pET系列的载体，如pET-21a；更优选的，所述在毕赤酵母中表达的载体为pPIC9K载体。