[发明专利]一种rmpA的酶活反应测定方法

说明书

本发明公开了一种rmpA的酶活反应测定方法，包括如下步骤：步骤一：制备D‑ribulose 5 phosphate和甲醛备用；步骤二：通过PCR扩链rmpA的RNA，扩链后通过无细胞蛋白表达体系进行蛋白表达；步骤三：将蛋白表达后的rmpA作为催化蛋白进行D‑ribulose 5 phosphate与甲醛的加成反应，通过检测甲醛的方法测定初始甲醛含量以及反应过程甲醛含量，计算其酶活，利用rmpA对甲醛和D‑ribulose 5 phosphate的合成催化作用，通过甲醛的含量变化来体现rmpA酶的活性，甲醛的含量检测简便；用反应的进行可以进行动态测定，确定其酶活过程的动态结果，可以更精确，更灵活的完成测定。

技术领域

本发明涉及rmpA酶的检测技术领域，特别涉及一种rmpA的酶活反应测 定方法。

背景技术

超级细菌(superbug)不是特指某一种细菌，而是泛指那些对多种抗生 素具有耐药性的细菌，它的准确称呼应该是“多重耐药性细菌”。这类细菌 能对抗生素有强大的抵抗作用，能逃避被杀灭的危险，而rmpA是控制其中一 种超级细菌蛋白的基因。肺炎克雷伯菌(Kpn)是临床分离及医院感染的重要 致病菌之一，随着β-内酰胺类及氨基糖苷类等广谱抗菌素的广泛使用，细菌 易产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)以及氨基糖苷 类修饰酶(AMEs)，对常用药物包括第三代头孢菌素和氨基糖苷类呈现出严重 的多重耐药性。肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，且多耐药性 菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。

肺炎克雷伯菌耐药机制主要包括产生β-内酰胺酶、生物被膜的形成、外 膜孔蛋白的缺失、抗菌药物主动外排等，抗菌药物耐药基因水平播散是多药 耐药菌株临床加剧的重要原因。rmpA可以放大肺炎克雷伯菌不同血清型的菌 落粘液质，并作为质粒介导的囊外多糖合成调节因子。

目前关于rmpA的酶活测定方法研究较少，且酶活对于整个反应过程及结 果都有很重要的作用，但无法直接检测rmpA酶活，更无法深入进行rmpA的 研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测rmpA的酶活反应测定方法，其具有检测灵 活、准确的优点。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种rmpA的酶活反应测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：制备D-ribulose 5phosphate和甲醛备用；

步骤二：通过PCR扩链rmpA的RNA，扩链后通过无细胞蛋白表达体系进 行蛋白表达；

步骤三：将蛋白表达后的rmpA作为催化蛋白进行D-ribulose 5 phosphate与甲醛的加成反应，通过检测甲醛的方法测定初始甲醛含量以及 反应过程甲醛含量，计算其酶活。

D-ribulose 5phosphate和甲醛在rmpA催化的作用反应生成 D-arabino-hex-3-ulose 6-phosphate，反应式如下：

进一步设置：检测甲醛的方法为利用乙酰丙酮法，甲醛与乙酰丙酮及氨作用 生成黄色的3，5-二乙酰基-1，4二氢卢剔啶，用10mm比色杯在412nm波长 下测定吸光度。

进一步设置：检测甲醛的方法为利用酚试剂法，甲醛与酚试剂反应生成 丫嗪，其在酸性溶液中被铁离子氧化成蓝色，用10mm比色杯在635nm波长下 测定吸光度。

进一步设置：检测甲醛的方法为利用副品红法，亚硫酸根离子在甲醛存 在的条件下，与副品红生成紫色络合物，在570nm波长下测定吸光度。

进一步设置：步骤3中催化反应的反应温度控制为37℃。