[发明专利]一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，细胞株和应用

权利要求书

1.一种小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：

(1)将小鼠肠癌细胞进行抗生素标记和生物光学标记，在体外培养至80％-90％的融合状态，收集细胞，将细胞用缓冲液轻柔洗涤1-2次，以0.1wt％-0.5wt％胰酶消化后收集在缓冲液中重悬，制成浓度为2*10⁶-5*10⁷/ml的细胞悬液a，将0.1-0.5ml所述细胞悬液a注射到小鼠皮下进行体内适应；

4周后或肿瘤的体积超过2cm³后处死小鼠，将形成的皮下肿瘤组织取出，在体外经过酶消化处理成单细胞悬液，在体外根据小鼠肠癌细胞抗生素抗性筛选培养，去除其他非肿瘤细胞和细胞碎片后，再选取对生物标记呈阳性的细胞；

(2)将步骤(1)得到的细胞体外扩增培养后，收集在缓冲液中重悬，制成5*10⁷-5*10⁸/ml的细胞悬液b，用盲肠壁种植法处理新的活小鼠，用注射器将5-20ul所述细胞悬液b注射到浆膜下层；

(3)4-6周后或小鼠体内原位的肿瘤长至1cm³后处死小鼠，取出盲肠注射肿瘤细胞的小鼠的肝脏的转移灶组织，经过酶消化处理成单细胞悬液，在体外根据小鼠肠癌细胞抗生素抗性筛选培养，再选取对生物标记呈阳性的细胞；

(4)将步骤(3)得到的细胞体外扩增培养后，重复步骤(2)和步骤(3)的过程1-3次，4-5周后或至80％以上的小鼠在盲肠注射后发生肝脏转移后获得细胞珠。

2.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的缓冲液为PBS缓冲液，包括130-145mM的NaCl，22-35mM的KCl，8-15mM的Na₂HPO₄和15-25mM的KH₂PO₄，PH为7.2-7.6。

3.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中制成浓度为1*10⁷/ml的细胞悬液a，将0.1ml所述细胞悬液a注射到小鼠皮下进行体内适应。

4.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(3)中的酶消化处理中采用的酶包括浓度为150-300units/ml的胶原酶、浓度为25-40NF units/ml的透明质酸酶和浓度为250-320units/ml的DNA酶。

5.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中制成5*10⁷/ml的细胞悬液b，用注射器将10ul所述细胞悬液b注射到用盲肠壁种植法处理新的活小鼠的浆膜下层。

6.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增培养的条件为：温度37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2-4mM的L-谷氨酰胺,1000-4500mg/L的葡萄糖,0-1.2mM的丙酮酸钠,1500-2200mg/L的碳酸氢钠，0-10mM HEPES，2％-20％胎牛血清和1-10μg/ml抗生素。

7.根据权利要求1所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中扩增培养的条件为：温度37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱，细胞扩增培养的培养基中包括2-4mM的L-谷氨酰胺,1000-4500mg/L的葡萄糖,0-1.2mM的丙酮酸钠溶液,1500-2200mg/L的碳酸氢钠溶液，0-10mM HEPES，2％-20％胎牛血清和1-10μg/ml抗生素。

8.权利要求1-7任一项所述的小鼠肝脏高转移肠癌细胞株的建立方法得到的细胞株。