[发明专利]双特异性嵌合抗原受体T细胞，其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种双特异性嵌合抗原受体T细胞，其制备方法和应用。本发明基于人NKG2D和人SIRPα分子构建的双特异性靶向人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体以及其修饰的免疫应答细胞，该新型的修饰的免疫应答细胞能有效地靶向攻击多种肿瘤细胞，尤其是表达NKG2DL和CD47的阳性肿瘤细胞，可用来制备用于治疗肿瘤的制剂。本发明的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞制备方法步骤简单，获得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤率高。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗生物医药技术领域，涉及特异性嵌合抗原受体T细胞，具体地，涉及一种双特异性靶向人NKG2DL和人CD47的、包含人NKG2D和人SIRPα蛋白或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)，其修饰的免疫应答细胞，及其制备方法和应用。

背景技术

随着生物技术的飞速发展，免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。

癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫检验点阻断治疗等。其中，在细胞治疗领域，嵌合抗原受体修饰的免疫细胞(特别是ChimericAntigen Receptor T-Cell,CAR-T)疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追捧”的明星。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表的免疫疗法，其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的T细胞进行嵌合抗原受体的修饰形成CAR-T细胞，该T细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而靶向杀伤肿瘤。相对于常规免疫细胞，CAR-T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性都更高，并且可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。该以CAR-T细胞为代表的修饰免疫细胞疗法在白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

然而，90％的癌症是实体瘤，更多种类的实体瘤以及更多的肿瘤表面特异性靶点抗原有待进一步确认。CAR-T免疫疗法应用于实体瘤治疗的最大难点在于CAR-T细胞对于肿瘤细胞上抗原表达的特异性要求非常高，容易造成T细胞持续激活而杀伤正常细胞，或释放大量细胞因子引起严重毒副作用，但肿瘤特异的靶向抗原可选择性并不多，并且，肿瘤表达的大多数抗原不具备肿瘤特异，以肿瘤相关抗原作为靶点的CAR-T免疫疗法存在“脱靶”等问题。研究更广谱、高效、安全的CAR-T免疫治疗方法是时急需解决的问题。

发挥嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞技术应用的关键在于确定至少一种肿瘤相关的抗原，这种抗原在肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞表面无表达或低表达。近年来，NKG2DL蛋白和CD47蛋白成为备受关注的两个实体瘤标志性靶标。

NKG2DL蛋白的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，通常在不同来源的各种肿瘤细胞表面有较高水平的表达，NKG2D-NKG2DL系统在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，NKG2D通过识别肿瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。NKG2DL的表达作为机体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变，激活NKG2DL蛋白-NKG2D配体系统为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，为相关新疗法和药物的开发提供了启示。

此外人体有两个不同的免疫系统，一个是以T细胞为代表的获得性免疫系统，另一个是以巨噬细胞为代表的先天性免疫系统。巨噬细胞在细胞吞噬、抗原呈递、免疫应答、维持细胞稳态、病原体防御以及抗肿瘤免疫调节等方面发挥重要功能。然而肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤的关系似乎比较复杂：肿瘤组织之外的巨噬细胞可以直接杀伤肿瘤细胞；肿瘤组织中的巨噬细胞可分泌生长因子滋养肿瘤细胞，促进肿瘤的血管生成，导致肿瘤侵袭转移，而在肿瘤组织内部的巨噬细胞越多对肿瘤杀伤效果越差。