[发明专利]天然组织来源的脱细胞骨膜基质凝胶材料的制备方法

说明书

本发明公开了一种天然组织来源的脱细胞骨膜基质凝胶材料的制备方法，本发明将哺乳动物来源的脱细胞骨膜基质通过冷冻干燥，最大化保留生物活性分子；并将其研磨成粉、控制粉末粒径，增加溶液接触面积从而加速消化，得到具有良好成骨活性潜力的标准统一化的脱细胞骨膜基质凝胶。此外，通过EDC交联生长因子，对实现新生骨组织的优异再生、血管化长入具有很好的促进效果。可用于修复临床上各类病因造成的骨缺损，骨不愈合等多种骨再生障碍问题。

技术领域

本发明属于骨组织修复及其再生技术领域，具体涉及天然组织来源的脱细胞骨膜基质凝胶材料的制备方法。

背景技术

骨缺损是临床常见疾病，往往会造成骨不连接、延迟愈合或不愈合及局部功能障碍，对患者造成痛苦，导致其行动受限，生活质量受到严重影响。传统人工合成材料虽然能提供足够的力学支撑，但其生物活性差，骨诱导性不足，不易降解，甚至引起异物反应。目前，治疗骨缺损和骨坏死等的方法以自体骨移植和同种异体骨移植为主，但自体骨移植会产生二次损伤，而同种异体骨移植因存在潜在免疫和疫病传播风险，因此亟需研发新的具有良好骨愈合再生修复效果的骨组织工程材料。

细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)是由细胞合成并分泌到胞外的大分子，主要成分包括胶原纤维、糖蛋白、多聚糖、生长因子等。ECM构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构，调节组织细胞的生长等系列生理活动。水凝胶是组织工程中一类较受关注的支架材料体系，具有可注射，损伤小，任意塑形等优点。而常见的水凝胶产品有单一或少数特定成分构成，难以完美模拟生物组织成分，若负载另外的生长因子或活性分子，有产生副效应和致瘤等风险。申请号为201410145791.7的专利公开了一种脱细胞基质凝胶及其制备新方法，脱细胞、消化后通过较低温恒温孵育减少了对组织的损伤。申请号为201811452768.7的专利公开了一种脱细胞基质凝胶制备的方法，除了采用温和的脱细胞法，还在脱细胞基质凝胶消化后，在加压条件下进行处理，获得了较好修复效果。

但既往脱细胞基质凝胶材料的制备通过剪碎方式无法获得足够的比表面积，不利于消化液的充分接触，生物活性物质保留低。此外，目前并未有骨膜ECM凝胶标准化制备的产品。骨膜是骨的重要组成部分，骨膜ECM的组织特异性更有利于骨的再生修复，是其他异位组织作为修复材料所无法取代的。因此，基于上述背景，本专利提出一种通过冷冻干燥的方案实现对骨膜ECM活性分子的最大保留；并且将ECM研磨成粉增加溶液接触面积；通过筛网过滤控制粉末粒径，标化消化步骤。从而得到具有生物活性高保留、标准统一化的骨膜ECM凝胶修复材料。此外，通过EDC交联生长因子，对实现新生骨组织的优异再生、血管化长入具有很好的促进效果。可用于修复临床上各类病因造成的骨缺损，骨不愈合等多种骨再生障碍问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生物活性物质高保留的脱细胞骨膜基质凝胶材料及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：对天然组织来源的骨膜组织经脱细胞处理后，通过冷冻干燥、磨粉、凝胶处理，得到高活性的骨膜ECM凝胶材料。并通过修饰胶的技术，引入生物活性因子(VEGF、FGF)，将其接枝于凝胶胶原纤维网络，实现特定功能的组合。

所述的天然组织来源的骨膜组织包括哺乳动物骨组织骨膜为四肢长骨骨膜以及颅骨骨膜；所述的脱细胞技术包括蛋白酶抑制剂、KCl、KI、丙酮、磷酸三丁酯、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等化学试剂和物理冻融法组成的脱细胞方案，具体包括以下步骤：

a)将初步去除骨膜周边肌肉、筋膜和脂肪作为原材料；

b)将骨膜组织材料用无菌水漂洗3次，每次20分钟，去除残余的肌肉、筋膜和脂肪，用24kGy剂量的γ射线照射24h，杀灭存在的细菌和病毒；

c)将b)得到的材料经磷酸三丁酯与去离子水处理12-24小时；磷酸三丁酯与去离子水的体积比为1％-5％；