[发明专利]一种氧化石墨烯亲和固定化载体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种氧化石墨烯亲和固定化载体及其制备方法与应用，该亲和载体的制备包括氧化石墨烯的羧化、氧化石墨烯羧基的活化、聚乙二醇氨的修饰、螯合配基的修饰以及Ni²⁺的螯合。通过本发明得到的亲和载体可以有效的解决其它亲和载体如氧化石墨烯直接修饰Ni²⁺以及氧化石墨烯先修饰螯合配基再修饰Ni²⁺造成的固定化酶失活问题。通过本发明得到的固定化酶具有酶活高、酶活损失少等优势。

技术领域

本发明涉及纳米材料固定化酶，属于纳米复合材料领域，具体是一种氧化石墨烯亲和固定化载体及其制备方法与应用。

背景技术

补充背景技术

酶是一类具有催化功能的生物分子，它在食品、医药以及工业生产中均有广泛应用。酶的特点包括高效性、专一性、反应条件温和。但是游离酶环境敏感性强，难以重复利用且不利于后续产物的分离，在工业化生产中存在诸多问题。为了解决这一难题，固定化酶技术应运而生。它是将水溶性酶通过选用不同的固定方法以及固定载体，变为不溶于水但仍具有催化活性的一种生物技术。固定化酶较游离酶有很多优点，如稳定性高、可进行工艺加工、可重复使用以及利于后续分离。固定化酶技术从20世纪60年代发展至今，已成为生物技术中最热门的研究领域。

传统的固定化酶方法包括吸附、共价结合、包埋以及交联。但是，这些方法存在许多不足之处。吸附法容易造成酶的解吸附；共价结合容易破坏酶的结构；造成酶活回收率的大幅度损失；包埋容易造成底物的传质受限；交联反应较为激烈，酶活力损失较大。酶固定化的新趋势是在“活化的”支持物和蛋白质表面上存在的特定基团之间产生不同的(生物)亲和键，这种相互作用发生在生物体的几乎所有重要生物过程中，如抗体和抗原、生物素和亲和素、金属离子和组氨酸标签等。亲和固定化提供了若干优点，包括：(1)与所有生物分子相似的选择性和定向固定，因为“结合位点或支持物的特定基团”具有相同的连接，(2)酶结构中诱导的构象变化的最小化，和(3)用酶重新加载相同的活化表面并根据不同的需求重新使用载体的可能性。

通过特定的亲和力相互作用固定酶有两个主要要求：(1)生物相容性载体的选择，该载体应具有必需的官能团(具有非常高的亲和力)并且能够特异性识别目标蛋白质外表面上存在的靶基团或者可以容易地官能化(2)酶表面上特定基团的可用性。因此，生物相容性载体的选择至关重要。在大多数情况下，一些载体如无机氧化物、矿物质等不能满足酶亲和的要求，很少应用于亲和固定化。相比之下，生物聚合物如壳聚糖以及琼脂糖通常具有高蛋白质亲和力以及生物相容性，可用作亲和固定化的载体。随着亲和固定化酶的实际应用可能性的不断增长，一些新型的载体如二氧化硅、磁性纳米粒子、碳纳米管、复合材料以及氧化石墨烯也广泛用于亲和固定化。

氧化石墨烯由于其独特的优势如高比表面积、良好的热稳定性和化学稳定性、易于官能化和表面易调控等已被用作不同生物技术应用中酶固定的基质。Hermanová等人将脂肪酶固定在氧化石墨烯上，固定化酶具有高活性以及高稳定性；Su等人通过戊二醛将碱性蛋白酶共价结合到氧化石墨烯上，与游离酶相比，固定化蛋白酶的热稳定性和可重复使用性得到了明显改善；Zhou等人以多巴胺修饰氧化石墨烯用于葡萄糖氧化酶的固定化，实验结果表明，固定化酶热稳定性和pH稳定性均得到显着提高。

然而氧化石墨烯作为固定化载体常常导致酶结构和功能的显着损失，如辣根过氧化物酶(HRP)和酯酶与氧化石墨烯结合后损失约70％的活性，酶活性的显著丧失可能与疏水性以及静电性有关。这也使得以氧化石墨烯作为亲和固定化载体的报道相对较少。聚乙二醇氨是一种人工合成的高分子材料，具有柔顺、亲水、良好的生物相容性以及对酶结构惰性等特点。在固定化过程中，其可通过其链结构的柔顺性来延长酶蛋白与载体分子作用时间而减少其反冲力，维持酶的正确构象。载体经聚乙二醇氨修饰后，由原先刚性以及疏水性质变为柔顺以及亲水性质，减少酶与载体之间的碰撞作用，维持酶分子的正常构象，同时，聚乙二醇氨的修饰使酶与载体之间的距离较远，从而使酶具有较高的自由度，有利于酶与底物之间的亲和。综上所述，以聚乙二醇氨功能化氧化石墨烯以用作亲和固定化的载体是可行的方法。