[发明专利]一种痕量cfDNA提取对接高通量测序文库的优化方法

说明书

本发明专利涉及到一种痕量cfDNA提取对接高通量测序文库的优化方法，主要特征在于，溶液收集后加入等体积的酚氯仿，再加入100ng carrier DNA混合，并制备高效液相分离管，将消化后的液体转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，可回收98％以上的DNA溶液量。本发明专利具有获得更高的文库量和操作简单等特征。

技术领域

本发明属于生物医药服务领域，具体涉及一种痕量cfDNA提取对接高通量测序文库的优化方法。

背景技术

游离循环DNA(cfDNA)存在于血液，包含双链DNA片段，绝大多数是短链，而且通常浓度很低。在健康人体中，血浆cfDNA被认为来自于正常的造血细胞。cfDNA的循环半衰期很短，这提示它需要在细胞凋亡时被持续的释放。在特定的生理条件或疾病过程中，有相当一部分cfDNA会与在健康的时候不同，基于这一结果，近年来cfDNA已被用于无创性诊断。在孕妇中，约有10％-15％的cfDNA来自于胎盘滋养层，现在cfDNA多用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷，这就是是当前火热的无创唐氏筛查的基础！在肿瘤病人中，通过cfDNA的量化突变来检测肿瘤已被越来越多的人认可。而在移植方面，移植排斥反应也与供体移植器官中的cfDNA水平相关。

cfDNA(Circulating cell-free DNA)、CTC和外泌体的检测。目前GenomeAnalyzer IIx系统能够同时对数亿的序列进行测序，极大的扩展了基因组学，转录组学以及表观遗传组学等领域的研究分析能力。

然而，关于痕量cfDNA提取对接高通量测序文库的方法存在着文库量比较低等问题。

发明内容

本发明专利根据上述问题，提供了以下技术方案：

一种痕量cfDNA提取对接高通量测序文库的优化方法，主要特征在于，溶液收集后加入等体积的酚氯仿，再加入100ng carrier DNA混合，并制备高效液相分离管，将消化后的液体转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，可回收98％以上的DNA溶液量。

进一步的，所述方法优化步骤包括如下：

(1).取200ul的血浆/血清样品到1.5ml的离心管中；

(2).加入10μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入20ul的裂解液；

(3).涡旋震荡10sec混匀后，放入预热至50-60℃的恒温中过夜；

(4).溶液收集后加入等体积的酚氯仿，再加入100ng carrier DNA混合；

(5)制备高效液相分离管；

(6).将消化后的液体转移到高效液相分离管，高速离心进行液相分层，可回收98％以上的DNA溶液量；

(7).加入1.3ml体积的无水乙醇，100ul3M醋酸钠PH5.2，最大转速4°离心60sec，弃上清；

(8).再加75％-80％酒精洗涤一次最大转速4°离心60sec，弃上清。重复该步骤一次；

(9).晾干后水溶解；

(10).进入常规高通量测序文库构建。

进一步的，所述步骤(3)中恒温方式为金属浴，水浴，沙浴；

进一步的，所述步骤(4)中加入100ng carrier DNA混合，carrier DNA为提取的高纯度的线粒体DNA，用于提高溶液复杂度，提高cfDNA得率。

进一步的，所述步骤(5)制备高效液相分离管主要制备流程如下：