[发明专利]一种CAR-T细胞及其应用

权利要求书

1.一种CAR-T细胞，其特征在于：CAR分子包括依次串联的引导序列、胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内刺激信号区，所述的胞外识别区为uPA的A链上的CD87结合位点，胞外识别区的核苷酸序列为SEQ ID No.1；所述的引导序列为CD8α的信号肽、所述的铰链区为CD8α铰链区、所述的跨膜区为CD8α跨膜区，所述的胞内刺激信号区为CD28-CD137-CD3ζ，所述的CAR-T细胞的嵌合抗原受体的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

2.如权利要求1所述的CAR-T细胞的构建方法，具体步骤如下：

S1、确定第三代嵌合抗原受体的过表达序列：CAR-T细胞的嵌合抗原受体的核苷酸序列为SEQ ID No.2，包括信号肽、胞外识别区SEQ ID No.1、顺次连接的CD8α胞外区50个氨基酸和CD8α跨膜区和CD28-CD137-CD3ζ形成的核苷酸序列SEQ ID No.5；

S2、构建慢病毒载体和包装慢病毒：将所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列SEQ ID No.2连接于过表达慢病毒主质粒上，经过酶切鉴定步骤确定过表达片段的准确性，将慢病毒主质粒配合病毒包装辅助质粒对293T细胞使用转染试剂进行共转染，经过细胞培养和上清液浓缩得到慢病毒颗粒，最后检测滴度后保存于-80℃超低温冰箱，半年内使用；

S3、T细胞的分离和扩增培养：收集健康成年人外周静脉血，从中分离出T细胞进行扩增培养；采用步骤S2中制得的慢病毒对上述培养得到的T细胞进行转染并扩增培养，获得CD87-CAR-T细胞。

3.如权利要求1所述的CAR-T细胞在制备治疗CD87阳性的恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的CD87阳性的恶性肿瘤为卵巢癌。