[发明专利]多酶重组细胞及多酶级联催化合成D-泛解酸内酯的方法

说明书

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种重组细胞及其在催化合成D‑泛解酸内酯中的应用。所述重组细胞诱导产生L‑泛解酸内酯脱氢酶、D‑酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，能够将DL‑泛解酸内酯或L‑泛解酸内酯去直接合成D‑泛解酸内酯。本发明还提供了一种多酶级联直接催化合成D‑泛解酸内酯的方法，与工业上应用的酶法拆分技术相比，简化了反应过程，提高了反应效率。

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种多酶重组细胞及其在合成D-泛解酸内酯中的应用。

背景技术

D-泛解酸内酯是合成D-泛酸和D-泛醇的重要中间体。工业化合成D-泛解酸内酯是采用化学法和水解酶拆分法相结合的技术路线，以廉价的异丁醛和甲醛为起始原料，异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛；再添加氢氰酸氰化，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯；D-泛解酸内酯水解酶选择性水解D-泛解酸内酯生成D-泛解酸，再经内酯化生成D-泛解酸内酯，留下的L-泛解酸内酯经化学消旋化为DL-泛解酸内酯重新循环拆分。DL-泛解酸内酯是合成D-泛解酸内酯中的关键步骤。水解酶的手性拆分制备工艺需要L-泛解酸内酯的消旋，D-泛解酸和L-泛解酸内酯的分离以及D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯。水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，仍然存在过程复杂、能耗物耗较高、需要消耗较多的酸碱等问题。研究者在生物法或酶法高效、绿色地合成高光学纯度的D-泛解酸内酯方面已做了诸多探索，其中又以基于氧化还原酶的多酶级联催化新工艺最具应用潜力。

多酶组合的一锅法催化过程具有相当多的优点：缩短反应时间，降低产品回收过程的步骤和化学品需求，改变可逆反应的平衡使其往期望的方向转移，消除部分或全部的底物产物抑制问题，减少不稳定中间产物的形成和积累等。Si Dayong等人利用三个氧化还原酶的级联构建了L-泛解酸内酯手性反转为D-泛解酸内酯的新工艺，通过Rhodococcuserythropolis中的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，中间产物酮基泛解酸内酯会自发水解成酮基泛解酸，之后在D-酮基泛解酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的双酶作用下全部的酮基泛解酸被还原成D-泛解酸，D-泛解酸在酸性条件下最终闭环形成D-泛解酸内酯。在该级联反应体系中，当底物浓度为0.768mol/L时，L-泛解酸内酯的转化率为91.9％，当浓度达到1.15mol/L时，其转化率可达80％(Si D,Urano N,Nozaki S,etal.L-Pantoyl lactone dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis:geneticanalyses and application to the stereospecific oxidation of L-pantoyllactone.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95:431-440)。该方法因为涉及中间产物酮基泛解酸内酯的水解，D-酮基泛解酸还原酶的使用以及后续D-泛解酸酸性成环成D-泛解酸内酯，反应步骤较繁琐，消耗较多的酸，反应时长较长，尚达不到工业化应用的要求。

目前，尚未见生物法或酶法催化DL-泛解酸内酯去消旋化直接合成D-泛解酸内酯的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多酶重组细胞以及多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化直接合成D-泛解酸内酯的方法。

本发明第一方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞诱导产生L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶。

在一个优选例中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于嗜甲基拟无枝酸菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

进一步地，所述L-泛解酸内酯脱氢酶的编码核苷酸序列选自下组：(3a)SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列；(3b)与(3a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。