[发明专利]一种PS转座子系统及其介导的基因转移方法

说明书

本发明公开一种PS转座子系统及其介导的基因转移方法，包括可插入目的基因盒的两个末端重复序列的转基因供体质粒和提供转座活性的转座酶辅助质粒。通过PS转座子系统将目的基因导入受体基因组。本发明提供的基于PS转座子系统的基因转移方法，经过细胞和胚胎水平验证能够高效介导基因转移，可应用于多个生物技术领域：1）使用本发明中给出的方法可有效地将目的基因盒插入到宿主基因组中，提高基因转移效率；2）与基因捕获技术结合可以有效开展动物基因功能研究；3）可以介导进行人类基因治疗等。

技术领域

本发明涉及建立一种PS转座子系统介导的基因转移方法，同时还公开了该方法涉及的转基因供体质粒和转座酶真核表达及体外转录辅助质粒的构建方法，及其在制备转基因动物、研究基因功能和人类基因治疗中的应用。本发明属于动物基因工程领域。

背景技术

基因转移是当前一项重要的生物技术手段，可以介导外源基因稳定的整合到宿主染色体中，所以在研究基因功能、制备转基因生物和人类基因治疗等领域中都有重要的应用价值。

转座子是基因组上一段可以自由跳跃的DNA序列，首先是由Mc.Clintock于20世纪40年代在玉米染色体中发现，后又陆续在细菌、真菌及昆虫等各种生物中发现。经过对转座子的注解之后发现无论在原核生物还是真核生物中都存在相当数量的转座子。转座子在不同生物间分布存在较大差异，尤其是高等真核生物中含量更高，例如转座子是哺乳动物基因组中最大的组分，几乎占到人类基因组的一半，在玉米中几乎占到80％。DNA转座子的转座过程遵循“剪切-粘贴”的机制在基因组上进行移动，因此被作为有效的基因转移工具进行开发。近年来，转座子在人类基因治疗，转基因鼠和斑马鱼等模式生物制备和功能基因组学的研究上已经取得了重要的进展。除此之外，转座子作为基因转移的载体具有很多优势：1)结构简单，与外源基因共同整合入受体基因组的只是两侧的TIR序列，对外源基因的影响很小，在整合位点也没有发现大片段的丢失和染色体重排的现象；2)相较与病毒载体，DNA转座子载体对插入片段限制较小；3)外源基因可以稳定整合到染色体中，而且通过生殖细胞传代后也能够长期的表达；4)转座酶可以催化单拷贝的基因精确的插入手提序列中，不再依靠随机整合且插入片段的大小也不会发生变化；5)转座子系统可以全部以裸露的DNA形式给予，也可以DNA与RNA或者蛋白质的形式提供转座酶相结合进行转座，所以其免疫原性较低。其中研究最为广泛的DNA转座子Sleeping Beauty(SB)、PiggBac(PB)和Tol2，这三种转座子不仅发生起源不同，在转座活性、插入偏好性方面也存在差异，因此在应用上也有所区别。例如SB偏好插入位点是“TA”，但是对基因没有偏好性，所以SB转座子常被用于人类基因治疗；PB偏好插入位点是“TTAA”，而且偏好插入基因内部，所以常被用于功能基因研究、基因捕获等；Tol2则没有很明显的偏好插入位点，插入位置多为基因上游调控区，故常用来研究增强子捕获等。

显微注射已经被广泛应用，且技术成熟稳定，同时科学家们利用转座子介导基因转移的特点，进一步完善了转座子介导细胞质显微注射的方法。由于DNA转座系统中的转座酶含有核定位信号序列(NLS)，可以顺利的介导目的基因进入细胞核，注射可以不入核，直接进行细胞质注射。所以这项技术正受到重视，并取得了令人鼓舞的进展，这可能是突破大型哺乳动物转基因技术瓶颈的新方法。

转座子用于人类基因治疗主要包括目的基因克隆、基因转移、靶细胞选择和临床试验观察等阶段，其中基因转移则是基因治疗的关键步骤，而DNA转座子介导的基因转移在基因治疗中的优点就是高效、安全。迄今为止，转座子已经称为基因治疗中最常用的非病毒载体。此外，转座子还可以制备突变体，开展基因捕获，应用与功能基因组学研究。