[发明专利]一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用

说明书

本发明公开了一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用，属于酶工程领域。本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶BaCEs04在大肠杆菌中异源表达，得到的羧酸酯酶BaCEs04在Zn²⁺，NH⁴⁺存在下，分别提高了24.3％和23.5％的酶活，其余金属离子Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺对酶活几乎没有影响甚至有略微的提高，说明该羧酸酯酶在存在金属离子的环境中较为稳定。该酶在丙酮，正己烷，异丙醇中放置1h后，酶活分别提高了22％、30％、26％，说明该酶具有较好的有机溶剂耐受性。

技术领域

本发明涉及一种耐金属离子和有机溶剂的羧酸酯酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)是指能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶。羧酸酯酶在生产和实际生活中应用广泛，并且已经得到了越来越多现代药物工业、手性化合物合成以及精细化工等相关行业的青睐。利用羧酸酯酶作为催化剂催化手性分子合成，例如生产萘普生和2-芳基萘酸；同时羧酸酯酶也被作为绿色催化剂降解土壤中的农药残留及土壤、水体中的塑化剂邻苯二甲酸酯类。由于产自动植物的羧酸酯酶存在着酶活低、产量少、提取复杂、热稳定性差等缺陷，而微生物来源的羧酸酯酶具有良好的区位选择性和立体选择性，可以高效温和的催化酯类和酰胺类化合物的水解、酯合成和酯交换等反应，在食品工业、生物去污剂、医药、能源开发和环境保护等相关领域都具有广阔的应用前景。

微生物中羧酸酯酶存在于真菌、细菌及个别种类的放线菌中。真菌在其中承担着重要作用，真菌中12属23种可产生羧酸酯酶；由于真菌来源的羧酸酯酶表达量少、酶活较低，而细菌来源的羧酸酯酶容易获得，酶学性质优异，催化效率高，所以细菌来源的羧酸酯酶越来越受到人们的关注。在细菌中羧酸酯酶主要存在于包括链球菌、乳杆菌、假单胞菌中。而野生菌中羧酸酯酶的表达量较低，不能满足工业应用；随着基因工程应用于羧酸酯酶的研究中，很多羧酸酯酶基因得到了异源表达。

但目前大部分羧酸酯酶对于金属离子和有机溶剂的耐受性较低，严重限制了羧酸酯酶的应用。例如谢振荣等人从脂环酸芽孢杆菌中克隆得到的羧酸酯酶CarE3和CarE5在1mM的不同金属离子Cu²⁺，Zn²⁺，Ag⁺，Fe³⁺中放置1h后，剩余的相对酶活均小于15％；将其放置于不同有机溶剂乙醇、甲醇、异丙醇和丙酮中放置1h后，酶活分别降低了28％、45％、70％和49％。Chenghong Wang等人从废水杆菌属中克隆得到的羧酸酯酶，当其在10mM不同金属离子中放置1h后，Zn²⁺，Ca²⁺，Fe³⁺对酶活性有轻度的抑制作用，而NH₄⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Ag⁺严重抑制的酶的活性。Nehad Noby等人从极端微生物中克隆出的酯酶EstN7，当其在5mM的不同金属离子中，酶活性受到Cu²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Na⁺金属离子不同程度的抑制作用。

且由于羧酸酯酶的大部分底物都是难溶于水的，耐有机溶剂的羧酸酯酶可以在含有有机溶剂的缓冲液(代替水相缓冲液)中更好的作用于底物，因此，获得一种既耐金属离子又耐有机溶剂的羧酸酯酶，在工业应用中将具有十分重要的价值和意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种降解含有金属离子或有机溶剂的体系中邻苯二甲酸酯类的方法，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶为催化剂，降解邻苯二甲酸酯类。