[发明专利]一种生物制剂中宿主残留rDNA的去除方法

说明书

一种酶制剂等生物制品中宿主残留DNA的去除方法，属于基因工程及酶制剂研究领域，本发明应用超滤、絮凝、鱼精蛋白处理、核酸酶降解及喷雾干燥等技术针对发酵液中rDNA对其进行处理。利用该技术最优条件下可将生物制剂中rDNA含量降至10ng/g以下。

技术领域

一种生物制剂中宿主残留rDNA的去除技术。所述的宿主为基因工程菌，属于生物工程领域。

背景技术

伴随着生物技术的发展，酶制剂、氨基酸、维生素等生物制品在食品、医药、农牧行业的应用日益增加。目前除木瓜蛋白酶等少数酶制剂是由动植物组织中直接提取之外，常见的酶制剂均由微生物培养获得，如饲用酶制剂的主要生产菌株即为利用基因重组技术构建的工程菌，而在氨基酸、维生素等大宗生物制品的生产中，多数也利用发酵法进行制备。尽管利用转基因技术能大幅度提高生产水平，但宿主细胞残留DNA却因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外监管机构关注的重点。如欧盟遵循“预防原则”，认为转基因技术存在着潜在风险，因此欧洲食品安全局(EFSA)规定出口至欧盟的生物制剂中重组DNA(rDNA)含量不得高于10ng/g。随着行业发展，人们对于转基因技术生产的产品中rDNA关注度日益增强，未来国家关于转基因技术的管控会愈加严格，因此本技术在生物产业的良性发展及降低转基因产品安全风险等方面均具有良好的应用前景。

目前国外生物制剂中rDNA去除技术主要依托不同孔径的滤膜过滤、絮凝、结晶等分离技术来降低产品中的rDNA含量，但由于酵母等高密度发酵的酶液含菌量高，且杂质较多，因此对滤膜等分离设备要求较高，且依靠单一的超滤技术不仅提高了生产成本，还会降低产品收率。国内目前关于酶制剂中rDNA含量暂无规范，在医药领域中rDNA主要依靠层析等技术去除，后处理成本高昂，不适用于工业化制备。未来低rDNA生物制品制备技术的发展将集中于不同分离技术与核酸酶降解技术的集成。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低酶制剂等生物制品中rDNA含量的方法；本发明提供生物产品或发酵液中rDNA的提取及检测方法以及酶制剂中rDNA的去除方法。

本发明要解决的第一个技术问题，是提供一种生物制品中微量DNA的提取及检测方法。所述提取方法为碘化钠提取法，即利用高浓度的促溶剂碘化钠使蛋白质溶解，然后加入异丙醇，并利用糖原和核酸共沉淀，从而特异性的使DNA沉淀抽提出来，提取率可达80％以上。

rDNA的检测使用荧光法，即利用标准DNA浓度与相应的荧光值建立标准曲线，并取一定量提取的待测DNA与荧光染料结合，根据荧光值计算得出样品的DNA含量，每组设2个平行。

本发明要解决的第二个技术问题，是提供一种生物制品中rDNA的去除方法。主要包括以下步骤：

1)测定表达菌株在不同培养时间上清液中的DNA含量，在一个优选的实施例中，酵母培养物前150h，其上清液DNA含量低于100ng/mL，而在150h之后，大量产酶细胞自溶凋亡，上清液中DNA含量迅速上升，184h时胞外DNA含量为544ng/mL。

2)先后利用板框及微滤膜对发酵液进行过滤除菌，对于含菌量较高的发酵液可进行多次过滤。

3)在发酵液上清中添加0.01％-2％的絮凝剂，絮凝剂可以是碱式氯化铝或聚合硫酸铁，并根据目的酶的耐热稳定性将温度控制在50-70℃之间，在一个优选的实施例中，将温度控制在70℃处理6h，不仅可将rDNA含量由424ng/mL降低至139ng/mL，还可以去除大量的杂蛋白并降低上清液粘度。

4)利用微滤膜对上述处理液进行二次过滤后，根据目的酶分子量选择孔径低于蛋白分子量的超滤膜对上清液进行超滤浓缩，在一个优选的实施例中选择30kDa滤膜对植酸酶发酵液进行浓缩，酶活收率可达85％，浓缩倍数6.5倍。