[发明专利]一种鸭腺病毒2型DNA疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明一种鸭腺病毒2型DNA疫苗及其制备方法和应用，属于免疫学技术领域。所述制备方法包括：合成如SEQ ID NO.3所示的DAV‑hexon序列；构建pcDNA3.1‑DAV‑hexon质粒；pcDNA3.1‑DAV‑hexon质粒转染293T细胞，在293T细胞中表达得到hexon蛋白即鸭腺病毒2型DNA疫苗。所述鸭腺病毒2型DNA疫苗由上述制备方法制得。所述鸭腺病毒2型DNA疫苗在制备预防鸭腺病毒2型疫病疫苗中的应用。本发明具有以下优点：SEQ ID NO.3所示的DAV‑hexon序列有利于抗原蛋白的表达；更能提高hexon的表达量；可对番鸭提供80％‑90％的攻毒保护。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种鸭腺病毒2型DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

鸭腺病毒2型(Duck adenovirus，DAV)是1977年从法国番鸭中爆发的大规模疾病中分离的一种病毒。2014年，奥地利科学家Ana Marek通过高通量测序技术才获得该病毒全序列，并对该序列进行分析。同年，广东地区番鸭场，番鸭出现类似该病死亡的情况。发病鸭肝脏肿大，斑驳状出血、白色点状坏死等症状。鸭2型腺病毒感染近年来在广东、广西、浙江、福建等地番鸭、樱桃谷鸭养殖场频频爆发，给我国养鸭业带来很大经济损失。目前有效预防该病的方法仍然是注射疫苗。DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的第三代疫苗，与传统疫苗相比，DNA疫苗拥有成本低，可诱导机体细胞免疫反应，免疫应答持续时间长等优点，具有巨大的应用前景。

鸭腺病毒2型属于I群禽腺病毒，病毒核酸为双股DNA。其中六邻体(hexon)是主要的结构蛋白，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，是中和抗体的靶目标和主要保护性抗原基因。本研究者从死亡发病的番鸭中分离获得鸭2型腺病毒，采用PCR等分子生物学手段获得了该病毒的hexon基因组序列。然后利用真核表达系统表达hexon蛋白，制备鸭腺病毒2型DNA疫苗。免疫保护实验中显示保护率能达到80％-90％，为预防鸭腺病毒2型疫病提供了方法。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种鸭腺病毒2型DNA疫苗的制备方法。

本发明第二个目的在于公开了上述制备方法制得的鸭腺病毒2型DNA疫苗。

本发明第三个目的在于公开了上述鸭腺病毒2型DNA疫苗的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种鸭腺病毒2型DNA疫苗的制备方法，包括下述步骤：

(1)、合成SEQ ID NO.3所示的DAV-hexon序列；

(2)、构建pcDNA3.1-DAV-hexon质粒；

(3)、pcDNA3.1-DAV-hexon质粒转染293T细胞，在293T细胞中表达得到hexon蛋白即鸭腺病毒2型DNA疫苗。

上述技术方案所述的制备方法，其中，步骤(2)的具体步骤为：将SEQ ID NO.3所示DAV-hexon序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，得到pcDNA3.1-DAV-hexon质粒。

上述技术方案所述的制备方法，其中，步骤(3)的具体步骤为：

(a)、转染前3h PBS洗涤293T细胞2次，更换不含血清培养基DMEM；

(b)、取0.5ug质粒DNA溶于50ul无血清DMEM中，轻轻混匀，室温静置5min；

(c)、将1.5ul的LipoHigh转染试剂溶于50ul无血清DMEM中，轻轻混匀，室温静置5min；

(d)、将步骤(c)制得的含有LipoHigh的稀释液加入步骤(b)制得的含有质粒DNA的稀释液中，轻轻混匀，室温静置20min；