[发明专利]一种基于铂纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的试剂盒

说明书

本发明公开一种基于铂纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的试剂盒，其特征是利用合成的铂纳米簇模拟氧化酶催化3‑甲基‑2‑苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和N‑乙基‑N‑（2‑羟基‑3‑磺丙基）‑3‑甲基苯胺钠盐偶合产物显色，鱼精蛋白可通过静电作用导致铂纳米簇聚集从而引起其催化活性降低，而鱼精蛋白会被胰蛋白酶水解，胰蛋白酶的存在有效抑制鱼精蛋白对铂纳米簇的聚集作用。因此，结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于胰蛋白酶及其抑制剂含量的测定。本发明提供的快速检测方法无须进行复杂的化学修饰或信号标记，抗干扰能力强，能快速、精确的实现对胰蛋白酶的快速检测，适于在临床应用，如胰腺炎等疾病的诊断。

技术领域

本发明涉及一种新型的胰蛋白酶含量检测方法和检测试剂盒，尤其涉及一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法及其检测试剂盒，属于纳米生物传感技术领域。

背景技术

胰蛋白酶（Trypsin, TRY）是由胰腺产生一类丝氨酸蛋白酶，主要作用是水解细胞间的蛋白质离散细胞，它广泛存在于脊椎动物的消化系统，在调节胰腺外分泌功能过程中也起着关键作用。研究表明，患有急性胰腺炎或胰腺移植病人的血液中胰蛋白酶的含量（1.4±0.6 μg/mL）水平比一般健康人（0.25±0.1 μg/mL）的要高，因此，胰蛋白酶在生物体液中的含量水平可作为胰腺功能和病理变化的生物标志物。综上，我们可以通过检测人体血液或者尿液中胰蛋白酶的含量，诊断人体胰腺功能正常与否。目前，检测胰蛋白酶的方法主要有：高效液相色谱技术、凝胶电泳技术、酶联免疫分析技术、化学发光和电化学分析方法等。这些方法相对比较耗时，或者有些需要复杂的修饰步骤，以及精密的仪器设备才能完成。因此，设计构建一种操作简单，无标记，且灵敏的方法对于胰蛋白酶的快速检测十分迫切。近几年来，纳米模拟酶具有较高的催化活性、卓越的生物相容性且稳定性高等特点，得到科研工作者的高度重视。这些特性让纳米模拟酶有望在环境监测、生物分析和疾病诊断等领域大有作为。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法。其中包括利用合成的铂纳米簇模拟氧化酶催化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐偶合产物显色，显色体系的最大吸收波长为590nm，由590 nm处吸光度可得出胰蛋白酶的含量。

为了实现上述快速检测方法的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是将胰蛋白酶和鱼精蛋白在Tris-HCl缓冲液中37 ℃下温浴2h，之后加入铂纳米簇溶液，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，目视观察颜色变化或测定紫外-可见吸收；所述的铂纳米簇溶液由以下步骤制得: 将1ml浓度为16mmol/L 氯铂酸溶液和1 mL 40 mmol/L 柠檬酸钠加入到38ml超纯水中，室温下搅拌混匀两分钟，之后滴入200μl浓度为50mmol/L硼氢化钠用于还原氯铂酸；混合物在室温下不断搅拌1小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液，将柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液冷冻干燥得到铂纳米簇模拟氧化酶粉末。

所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是将10 µL不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和10 µL 0.2 mg/mL鱼精蛋白加入到480 μL浓度为10 mmol/L、pH8的Tris-HCl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50 μL铂纳米簇、250μL3 mmol/LN-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200 µL 0.5 mmol/L 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25 min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度。

所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是显色产物溶液颜色为紫色，随着胰蛋白酶浓度的增大，溶液颜色加深，目视观察溶液颜色的检测限为0.05 μg/mL。