[发明专利]一种基于铂纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的试剂盒

权利要求书

1.一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是将胰蛋白酶和鱼精蛋白在Tris-HCl缓冲液中37 ℃下温浴2h，之后加入铂纳米簇模拟氧化酶、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，在40℃下温浴25min后获得显色产物，目视观察颜色变化或测定紫外-可见吸收；所述的铂纳米簇模拟氧化酶由以下步骤制得: 将1ml浓度为16 mmol/L 氯铂酸溶液和1 mL 40 mmol/L 柠檬酸钠加入到38ml超纯水中，室温下搅拌混匀两分钟，之后滴入200μl浓度为50mmol/L硼氢化钠用于还原氯铂酸；混合物在室温下不断搅拌1小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液，将柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液冷冻干燥得到铂纳米簇模拟氧化酶粉末。

2.根据权利要求1所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是将10 µL不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和10 µL 0.2 mg/mL鱼精蛋白加入到480 μL浓度为10 mmol/L、pH8的Tris-HCl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50 μL铂纳米簇、250μL浓度为3 mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200 µL 浓度为0.5 mmol/L 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25 min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度。

3.根据权利要求1或2所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是显色产物溶液颜色为紫色，随着胰蛋白酶浓度的增大，溶液颜色加深，目视观察溶液颜色的快速检测限为0.05 μg/mL。

4.根据权利要求1或2所述的基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测方法，其特征是显色产物最大吸收波长为590 nm，根据590 nm波长处测得的吸光度作标准曲线，其快速检测的线性范围为1.0~70.0 ng/mL，检测限为0.6 ng/mL。

5.一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测试剂盒，其特征是试剂盒中包括a 液、b液、标准液和缓冲液，所述a液中含有0.40 mmol/L铂纳米簇模拟氧化酶溶液，b液中含有3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，标准液包括浓度为1.0、3.0、10.0、30.0、50.0、70.0 ng/mL的胰蛋白酶溶液，缓冲液为10mM、pH8.0的Tris-HCl溶液。

6.根据权利要求5所述的一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶快速检测试剂盒，其特征是所述的铂纳米簇模拟氧化酶由以下步骤制得的：将1ml浓度为16 mmol/L 氯铂酸溶液和1 mL 40 mmol/L 柠檬酸钠加入到38ml超纯水中，室温下搅拌混匀两分钟，之后滴入200μl浓度为50mmol/L硼氢化钠用于还原氯铂酸；混合物在室温下不断搅拌1小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液，将柠檬酸稳定-铂纳米簇水溶液冷冻干燥得到铂纳米簇模拟氧化酶粉末。

7.权利要求5或6任一所述的一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是作为胰蛋白酶快速检测。

8.根据权利要求7所述的一种基于铂纳米簇模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是将10 µL不同浓度的胰蛋白酶标准溶液和10 µL 0.2 mg/mL鱼精蛋白加入到480 μL浓度为10 mmol/L、pH8的Tris-HCl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50 μL铂纳米簇模拟氧化酶、250μL浓度为3 mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200 µL浓度为0.5 mmol/L 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25 min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在590nm处测定紫外-可见吸收度，绘制胰蛋白酶标准曲线或计算回归方程；在三个尿样中分别加入高、中、低三种浓度胰蛋白酶溶液，各加入10 µL 0.2 mg/mL鱼精蛋到480 μL浓度为10 mmol/L、pH8的Tris-HCl缓冲液中，在37℃中孵育2小时；之后，加入50 μL铂纳米簇模拟氧化酶、250μL浓度为3 mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和200 µL浓度为 0.5 mmol/L 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，在40℃下温浴25 min后获得显色产物，在590nm处测定紫外-可见吸收度，计算尿样中胰蛋白酶的含量和样品的加标回收率，结果如表1所示。