[发明专利]一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用，属于兽药生物制品技术领域。所述病毒以O/rV病毒株为基本病毒株，包括结构蛋白VP2第98位突变为苯丙氨酸。所述重组病毒的制备方法，在VP2中同时引入了两个点突变S93F和Y98F，但在病毒传代过程中稳定保留了Y98F。所述含VP2 Y98F的FMDV O/rV‑3具有良好的热稳定性，且具有良好的免疫效果。本发明构建的含VP2 Y98F耐热突变株O/rV‑3可作为优质灭活疫苗生产种毒，显著提高灭活疫苗中的有效抗原含量，增加灭活疫苗的免疫效力，用于我国口蹄疫的有效防控。

技术领域

本发明属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是严重威胁我国畜牧业发展的重大动物疫病。口蹄疫病原-口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus，FMDV)在我国长期驻留，引发疫情，不仅严重影响了畜牧业的健康发展，造成家畜及其产品的贸易障碍，而且给公共卫生和国家声誉造成严重的负面影响，因此我国十分重视对该病的防控。

FMDV属于小RNA病毒科，其基因组长约8500个核苷酸，由5'非编码区(Untranslated Regions，UTR)，一个大的开放阅读框(Openreading frame，ORF)和3'UTR组成。开放阅读框编码一个多聚蛋白，该蛋白经蛋白酶裂解加工后形成4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和10个非结构蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B1-3、3C和3D)。其中每一分子四种结构蛋白组成一个原体(5S)，每5个原体形成一个五聚体(12S)，12个五聚体组成病毒衣壳(75S)，病毒衣壳和RNA组成FMDV粒子(146S)。研究表明FMDV粒子对环境温度比较敏感，温度升高容易诱导病毒粒子解离成五聚体亚单位(12S)而导致疫苗的有效抗原(146S)含量降低，从而影响疫苗的免疫保护效力。因此，改善FMD疫苗的热稳定性，制备热稳定的FMD疫苗对于我国口蹄疫的防控具有重要意义。

近年来反向遗传操作技术的发展为改造病毒提供技术支持，其建立过程是通过在体外进行人工基因操作，使其建立的系统满足病毒复制和包装所需要的各种必要条件。但是由于反向遗传操作可能影响效率，例如成功拯救的重组狂犬病病毒其拯救效率较低，在10⁷个转染细胞中大约只获得1个病毒粒子。另外，重组病毒在动物细胞上有效复制产生细胞病变也会影响其拯救效率。同时反向遗传操作后的病毒后期传代过程中发生回复突变不能长期稳定保持有益生物学特性。同时现有技术中采用反向遗传操作技术对病毒的毒力或病毒的产量等生物特性进行改性，目前现有技术中还没有一套关于热稳定性口蹄疫O型标记病毒的拯救方案。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于基于FMDV反向遗传操作提供一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用，所述热稳定口蹄疫O型重组病毒不仅具有较好的遗传稳定性，而且热稳定性也显著提高。

本发明提供的一种热稳定口蹄疫O型重组病毒，以O/rV病毒株为基本病毒株，包括结构蛋白VP2第98位酪氨酸突变为苯丙氨酸。

优选的，突变后的结构蛋白VP2的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

优选的，突变后的结构蛋白VP2的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

本发明提供了所述热稳定口蹄疫O型重组病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)利用基因合成技术合成含结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸的特定核苷酸序列，插入pUC质粒中，得到pUC/VP2S93F+Y98F；

所述结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸均突变为苯丙氨酸的核苷酸序列为SEQIDNo.5；