[发明专利]一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法

说明书

本发明公开了一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，该方法利用番茄来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以甜菊甙为原料一步糖基化反应生产莱鲍迪苷E，同时采用定点突变技术，改造UDP‑糖基转移酶，进一步提高莱鲍迪苷E的产率。本发明的方法无需添加UDP‑葡萄糖和UDP，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖在蔗糖合成酶分解作用下获得UDP‑葡萄糖作为糖基化反应的原材料，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E。其中，莱鲍迪苷E产率可达65%以上；后期通过定点突变技术，经筛选获得N358F有益突变体，其催化莱鲍迪苷E产率提高，最高可达85%以上。与已有的莱鲍迪苷E制备方法相比，工艺步骤简单，成本低廉，且产率高，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法。

背景技术

甜菊糖作为目前已知的最甜的甜味剂，其甜度是蔗糖的250～450倍，而热量只有蔗糖的1/300，略带有轻微涩味。除此之外，甜菊糖还具备对高血压、肥胖症、糖尿病等辅助药理作用^[1,2]，因此，越来越受到人们的关注。甜菊糖是甜菊糖甙(Steviol glycosides)的总称，目前已从甜叶菊中分离鉴定出超过35种甜菊糖甙^[3]，包括甜菊甙(Stevioside)和莱鲍迪苷A、B、C、D、E、M(Rebsudioside A/B/C/D/E/M)等。甜菊糖甙结构围绕一个双萜甜菊醇为骨架，在C₁₃位羟基和C₁₉位羧基分别连接了不等的葡萄糖基团，其中，骨架上C₁₆-C₁₇之间的碳碳双键是提供甜菊糖甙甜味及功能的药理性基团^[3,4]。

不同甜菊糖甙的甜度有所差异^[5]，莱鲍迪苷E(Rebaudioside E)的口感无后苦味，甜度与蔗糖相似，其结构上较甜菊甙在骨架上的C19位侧链上多了一个葡萄糖基团，在甜叶菊的干叶片中含量甚微(远小于1％)，直接通过常规物理手段从甜菊糖甙中分离莱鲍迪苷E，难度大且收率极低。

专利申请CN 201110379733.7(一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法)和专利申请CN 201010131126.4(一种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶催化合成改性甜菊糖苷的方法)中均采用的是环糊精葡萄糖基转移酶催化合成甜菊糖苷，但是该酶不能只将单一的葡萄糖残基添加到甜菊糖苷底物分子上，其催化产物是较为复杂的混合物，后期分离难度较大。

专利申请CN 201410185097.8(甜菊苷生成莱鲍迪苷E的生物转化方法)和专利申请CN 201210288703.X(甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的方法)中采用的是利用黑曲霉菌CICC40430发酵，每24h添加甲醇诱导表达糖基转移酶(70～75kDa)并纯化，其转化率≥70％，但是黑曲霉菌生长周期长，且需要在培养过程中添加乙醇作为诱导剂，操作复杂，产量不高。本方法通过生物酶催化手段，以甜菊甙纯品为原料一步糖基化反应制备莱鲍迪苷E，工艺步骤简单，成本低廉，且产率高，具有重要的应用价值。

参考文献

[1]KOVYLYAEVA G I,BAKALEINIK G A,STROBYKINA I Y,et al.Glycosides fromStevia rebaudiana[J].Chemistry of Natural Compounds,2007,43(1):81-85.

[2]KINGHORN A D,KINGHORN AD.Stevia:the genus Stevia[J].Crc Press,2002.

[3]OLSSON K,CARLSEN S,SEMMLER A,et al.Microbial production of next-generation stevia sweeteners[J].Microb Cell Fact,2016,15(1):207-220.