[发明专利]一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法

说明书

本发明公开了一种诱变筛选高产3‑羟基丙酸菌株的方法，包括步骤1、出发菌株的选择：选用假丝酵母变种作为出发菌株；步骤2、菌株的活化；步骤3、菌株的多重诱变：氯化锂诱变；紫外诱变；亚硝基胍诱变；步骤4、诱变菌株的筛选：将步骤3所得到的右边之后的菌悬液分别梯度稀释，取不同浓度的菌悬液200μL涂布至筛选培养基上，30‑40℃培养48‑72h，挑选透明圈与菌落直径比值较大的单菌落进行保存；步骤5、诱变菌株的复筛：将步骤4所筛选的诱变菌株涂布于基础培养基中，28‑33.2℃，恒温水浴震荡培养24‑36h。本发明以假丝酵母变种为出发菌株，复合诱变得到可稳定遗传的高产菌株，其生产量明显高于目前的报道，为微生物发酵生产3‑羟基丙酸工业化提供了可能。

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法。

背景技术

3-羟基丙酸是三碳、无手性有机酸，与乳酸互为同分异构体。3-羟基丙酸具有羟基和羧基两个官能团，是很多光学活性物质的前体。它脱水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，还原生成1，3-丙二醇，聚合生成高分子材料，是一种重要的化工平台产品。2004年美国能源部将其列为当今世界12种最具潜力的化工产品之一。

目前，3-羟基丙酸的生产方法是化学合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯睛转化法。但在碳末端引入功能团有很大的难度，且其产品不易分离提纯，生产成本较高，生产过程存在不安全因素，而利用微生物发酵生产3-羟基丙酸可以有效地避免这些不利因素。微生物转化法生产3-羟基丙酸的研究始于20世纪60年代，但一直处于实验室阶段，主要包括构建基因工程菌法和野生菌发酵法。基因工程法生产3-羟基丙酸有两条途径：以葡萄糖为底物和以甘油为底物的生物转化路线。其中，北京工商大学的王凤寰等人通过在肺炎克雷伯杆菌(K.pneumonia)中表达来自酿酒酵母的乙醛脱氢酶(ALDH)，得到了一株能同时利用甘油耦连生产3-羟基丙酸和1，3-丙二醇的重组菌，其3-羟基丙酸的产量为5g/L。已知的可发酵生产3-羟基丙酸的野生菌株主要有：Han-senula miso、Fusarium merismoides、Candidarugosa、Byssochlamys sp.、Rhodococcus erythropolis LG12和Klebsiellaterrigena。其中，李冰和裴疆森从自然坏境中筛选可代谢产生3-羟基丙酸的微生物菌株土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)可以以甘油为唯一碳源生产3-羟基丙酸，产酸能力为1%(10g/L)，初次实现野生菌种从甘油直接装化生成3-羟基丙酸。

目前，国内外研究的3-羟基丙酸生产方法多为构建基因工程菌法，微生物发酵生产3-羟基丙酸的实际应用还很少。为此提出一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法。

发明内容

本发明提出的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，包括以下步骤：

步骤1、出发菌株的选择：选用假丝酵母变种作为出发菌株；

步骤2、菌株的活化：将所述出发菌株接入活化培养基中，37℃，150-165r/min摇床培养24-36h，然后将培养液涂布到筛选培养基上，35-42℃，培养36-48h，挑取单菌落，重复活化操作，进行二次活化，得到二次活化的酵母菌液；

步骤3、菌株的多重诱变：

氯化锂诱变：分别配制氯化锂浓度为0%、O.3%、0.5%、0.7% .0.9%、和1%的活化培养基取1mL二次活化的酵母菌液分别接入不同浓度的氯化锂活化培养基中，35-42℃，135r/min摇床培养24 h；

紫外诱变：然后取菌悬液8mL置于直径9cm的培养皿中，在磁力搅拌下用15W紫外灯照射30s、60s、90s、120s；