[发明专利]一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法

权利要求书

1.一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1、出发菌株的选择：选用假丝酵母变种作为出发菌株；

步骤2、菌株的活化：将所述出发菌株接入活化培养基中，37℃，150-165r/min摇床培养24-36h，然后将培养液涂布到筛选培养基上，35-42℃，培养36-48h，挑取单菌落，重复活化操作，进行二次活化，得到二次活化的酵母菌液；

步骤3、菌株的多重诱变：

氯化锂诱变：分别配制氯化锂浓度为0%、O.3%、0.5%、0.7% .0.9%、和1%的活化培养基取1mL二次活化的酵母菌液分别接入不同浓度的氯化锂活化培养基中，35-42℃，135r/min摇床培养24 h；

紫外诱变：然后取菌悬液8mL置于直径9cm的培养皿中，在磁力搅拌下用15W紫外灯照射30s、60s、90s、120s；

亚硝基胍诱变：称取亚硝基胍放入无菌离心管中，加入浓度为10¹¹个/mL的菌悬液，使亚硝基胍终浓度为0.5mg/mL，充分溶解后置于35-38℃恒温振荡，作用时间分别为15min、25min、35min、45min；

步骤4、诱变菌株的筛选：

将步骤3所得到的右边之后的菌悬液分别梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6后，取不同浓度的菌悬液200μL涂布至筛选培养基上， 30-40℃培养48-72h，挑选透明圈与菌落直径比值较大的单菌落进行保存；

步骤5、诱变菌株的复筛：

将步骤4所筛选的诱变菌株 涂布于基础培养基中，28-33.2℃，恒温水浴震荡培养24-36h，通过测定发酵液中丙酸的含量确定筛选的菌株。

2.根据权利要求1所述的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述假丝酵母变种(Candida sp.)，于2011年10月 14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5344。

3.根据权利要求1所述的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述活化培养基的组成为：葡萄糖20.00g，酵母浸膏10.00g，蛋白胨20.00g，琼脂粉20.00g，无菌水1000mL。

4.根据权利要求3所述的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述氯化锂活化培养基为所述活化培养基中加入不同浓度的氯化锂。

5.根据权利要求1所述的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述筛选培养基的组成成分为：葡萄糖20. 00 g， 酵母浸膏、10.00g ，(NH₄)₂SO₄、10.00g ，KH₂PO₄、5.00g ，K₂HPO₄、2.00g ，MgSO₄ ·7H₂0、1.00g ，FeSO₄·7H₂0、0.03g ，丙酸、2.00g，琼脂粉、20.00g，无菌水、1000mL。

6.根据权利要求1所述的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述基础培养基的组成成分为：蛋白胨10.00g、蔗糖20.00g、酵母膏10.00g、(NH₄)₃PO₄ 5.00g，无菌水、1000mL。

7.根据权利要求1所述的一种诱变筛选高产3-羟基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述活化培养基、筛选培养基、基础培养基的pH均为7.0-7.5。