[发明专利]一种尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法

说明书

本发明涉及一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris‑HCl和氯化钠，洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris‑HCl,乙醇的体积浓度为30％～40％，洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris‑HCl，乙醇的体积浓度为75％～85％。本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行尿液游离DNA提取的方法。本发明提供的试剂盒对于尿液中游离DNA的提取效率高，且选择性提取100bp以上的核酸片段。

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种尿液中游离DNA提取试剂盒提取试剂盒及提取方法。

背景技术

基于尿液中游离DNA的液体活检正在被广泛研究，与血浆液体活检相比，尿液样本优势明显。首先，采样方便，不需要去专门的机构，在家即可完成，其次，是真正意义上的无创，不需要任何侵入采样；最后，样本量大，正常人晨尿一般在150mL以上。但是，相对而言，尿液样本会比较复杂，核酸酶含量更高，代谢物质更多，pH范围波动较大。正常人的尿液中游离DNA的来源主要是膀胱和尿道脱落的上皮细胞以及尿液中的少量白细胞破裂后被尿液中核酸酶降解而来，而对有疾病的人，其尿液中游离DNA的来源除上述外，还会有病灶部位凋亡和坏死的细胞进入尿液。

在2015年，BryzgunovaOE的综述文献报道，24小时内大约有3×10⁶个膀胱和尿道上皮细胞进入尿液，且尿液中核酸酶的活性高，核酸酶I(DNase I)在尿液中的活性是血浆中的100倍以上，血浆中的游离DNA也能通过肾脏过滤进入尿液，在多种类型的尿液样本中均有游离DNA的相关报道，在怀有男胎的孕妇尿液样本中检测到Y染色体的存在；胰腺癌和结直肠癌患者的尿液中发现KRAS基因突变；肺结核患者的尿液中检出结核杆菌的DNA；妇科和泌尿道疾病或HIV患者的尿液中含有HPV的DNA；恶性肾和膀胱肿瘤的基因突变和微卫星不稳定可在尿液样本游离DNA中检测到；前列腺以及膀胱肿瘤的异常DNA甲基化可在泌尿生殖癌患者尿液游离DNA中检出。故，尿液的游离DNA作为一种生物标记物，其研究和应用越来越广泛。

磁珠法尿液核酸提取一般分为四步：裂解-结合-洗涤-洗脱，与传统核酸提取方法相比，磁珠法DNA提取具有以下优势：1)能够实现仪器自动化、高批量操作，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，这一特点明显优于其他提取方法；2)操作简单、用时短，整个提取流程只需四部，大多可以在60分钟内完成；3)安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害大大降低；4)磁珠与核算的特异性结合使得提取的核酸的纯度和浓度都得到提升。

尿液的液体活检技术是以尿液中的游离DNA作为检测目标，在检测过程中游离DNA的含量是一个重要的指标，目前商业化的尿液游离DNA提取试剂盒较少，基于尿液游离DNA的研究，其提取多采用血浆游离DNA提取试剂盒，而血浆的游离DNA片段比较稳定，主峰大小为166bp，尿液的液体环境与血浆的液体环境不同，尿液中游离DNA的片段波动较大，从50bp到1kb，甚至膀胱癌患者的尿液游离DNA最大片段可以高达10kb，目前市面上并没有太多针对尿液中游离DNA的磁珠法提取试剂盒。

发明内容

本发明克服现有技术在尿液中游离DNA提取过程中，纯化效率低，纯度差、提取的核酸片段长度范围较窄的缺陷，提供了一种简单、方便、效率更高的尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠，所述裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠，所述洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为30％～40％，所述洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为75％～85％。