[发明专利]利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法

权利要求书

1.利用线粒体NADH5基因早期鉴别金边鲤的方法，其特征在于，鉴别的步骤为：

（1）提取待鉴定金边鲤的DNA；所述提取待鉴定金边鲤的DNA是采用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取，提取步骤为：

a、将10mg鱼鳍组织剪碎于1.5mL离心管中，加入200μL GA溶液混匀；

b、加入20μL蛋白酶K溶液混匀，56℃水浴消化直至组织溶解；

c、加入200μL GB缓冲液，充分颠倒摇匀，70℃水浴10min；

d、加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，将溶液转移至吸附柱CB3中，CB3吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

e、加入500μL GD溶液，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

f、向吸附柱CB3中加入600μL PW漂洗液，12000rpm离心30s，弃废液，重复此操作一次；

g、12000rpm离心2min，倒掉废液，吸附柱CB3开盖置于室温放置8min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

h、将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中滴加100μL TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

（2）利用引物对金边鲤个体DNA模板进行PCR扩增；

所述引物为：

F：CTCCCTAATCTTCGTCCCAA；

R：TTGGTGTTTTTATTGGTGGG；

PCR反应体系利用引物对金边鲤个体DNA模板进行PCR扩增，扩增内容为：

1）PCR反应体系：

80ng/μL DNA模板 1.0μL；

10μM正向引物F 0.5μL；

10μM反向引物R 0.5μL；

ddH₂O 8.0μL；

2×LA Taq PCR Mix 10.0μL；

2）PCR反应程序：先在94℃预变性5 min；再将以下程序循环30次：94℃变性30s，退火55℃1min，72℃延伸30s；

（3）对扩增产物进行回收；

所述对扩增产物进行回收为使用Biospin胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的DNA片段，具体步骤如下：

a、在凝胶成像系统下，用干净、锋利的手术刀切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，称重；

b、加入Extraction Buffer溶胶液，将凝胶和溶胶液以凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数=1：3的比例混合；

c、50℃恒温水浴10min，每隔2～3min摇匀一次，使胶块充分融化；

d、将溶液转移至Spin Column内，6000g离心1min，弃废液；

e、向Spin Column内加入500μL Extraction Buffer，12000rpm离心30s，弃废液；

f、向Spin Column内加入750μL Wash Buffer，静置5min，12000rpm离心30s，弃废液；

g、再次于12000rpm离心1min，然后将Spin Column转移到无菌的1.5mL离心管中；

h、向Spin Column内加50μL Elution Buffer，恒温静置1min；

i、于12000rpm离心1min，收集溶液得到回收产物；

（4）对引物的PCR扩增产物进行克隆并测序；

所述对引物的PCR扩增产物进行克隆并测序，具体内容为：

1）反应体系：

pMD18-T载体 1.0μL；

DNA片段 4.0μL；

Solution I 5.0μL；

2）操作步骤：

a、将引物的PCR扩增产物在16℃反应2h；

b、再将产物加入感受态细胞中，冰浴30min；

c、经42℃加热45s后，再在冰中放置2min；

d、加入500μL不含Amp的LB液体培养基，在37℃、200 rpm/min震荡30min；

e、取100μL上述所得溶液涂于含有Amp的LB固体培养基平板上，培养14h；

f、挑取单菌落，至含Amp液体培养基中，在37℃、200rpm/min培养3h；

g、将挑选并培养后的单菌落送至测序公司测序；

（5）对序列进行比对分析；所述对序列进行比对分析是将测序公司测定的序列输入NCBI数据库进行信息比对，获得序列信息的详细比对信息；再利用DNASTAR·Lasergene7.1软件包中的MegAlign软件将测序获得的序列与GenBank公开发表的鲤鱼序列做比较，序列在序列表序列1的247位点和559位点的碱基分别为A和C则为金边鲤，而其他鲤鱼对应位点的碱基分别为G和T。